Page 58 - 《中国药房》2023年8期

明书操作，以GAPDH为内参，检测NF-κB p65 mRNA表 表2 各组 BMSCs 的存活率及凋亡率比较（x±s，n＝
达。总反应体系为 50 μL，包含 5×缓冲液 10 μL、dNTP 6，%%）
混合物 2 μL、酶混合物 2 μL、5×Q-溶解液 10 μL、RNA 组别 存活率 凋亡率
酶抑制剂 1 μL、RNA 2 μL、上下游引物各 0.5 μL、无 对照组 78.2±1.9 16.5±2.7
模型组 45.2±3.2 a 51.3±3.0 a
RNA 酶水 22 μL。扩增条件如下：94 ℃预变性 5 min；
丁苯酞低浓度组 55.6±1.6 ab 39.6±1.5 ab
94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共行 丁苯酞中浓度组 63.6±3.1 abc 31.2±2.1 abc
35 个循环；然后 72 ℃延伸 10 min。采用凝胶图像分析 丁苯酞高浓度组 70.7±1.5 abcd 21.2±2.3 abcd
F 39.755 243.423
系统（3.0 版）分析 NF-κB p65 mRNA 表达水平。引物由
P ＜0.001 ＜0.001
生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，序列与产
a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与丁苯酞
物大小见表1。 低浓度组比较，P＜0.05；d：与丁苯酞中浓度组比较，P＜0.05
表1 引物序列与产物大小
基因 引物序列（5′-3′） 产物长度/bp
NF-κB p65 上游引物：ATGTGGAGATCATTGAGCAGC 151
下游引物：CCTGGTCCTGTGTAGCCATT
GAPDH 上游引物：TGTTCGTCATGGGTGTGAAC 154
下游引物：ATGGCATGGACTGTGGTCAT
2.7 NF-κB p65、caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达检测
采用Western blot法进行检测。按照“2.5”项下方法
A.对照组 B.模型组
取 BMSCs，培养、分组、给药，每组 6 个复孔，培养 24 h
后，吸弃培养基，以 PBS 清洗 3 次，用细胞裂解液（200
μL）裂解，离心收集上清蛋白质标本，采用 BCA 方法检
测蛋白质含量。蛋白变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离细胞总蛋白，取样20 μg进行电泳，电泳结束后将蛋白
质移至硝酸纤维素膜。取出膜置于室温条件下，用山羊
血清封闭3 h，加入兔抗大鼠NF-κB p65、caspase-3、Bax、
C.丁苯酞低浓度组 D.丁苯酞中浓度组
Bcl-2、GAPDH抗体（稀释比均为1∶200），4 ℃培育24 h；
加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释比为
1∶100），37 ℃培育 60～120 min，用 DAB 显色检测棕黄
色条带。拍照记录结果，运用 Quantity One 软件系统分
析图片的灰度值，以GAPDH为内参，以目标蛋白与内参
蛋白的灰度值比值表示目标蛋白相对表达量。
2.8 统计学方法
E.丁苯酞高浓度组
采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析。实验数据以 图1 各组BMSCs的凋亡染色图（Tunel法，×200）
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
比较采用LSD-t法。检验水准α＝0.05。 3.3 各组BMSCs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较
3 结果 如表3显示，与对照组比较，模型组和丁苯酞低、中、
3.1 各组BMSCs的存活率比较 高浓度组BMSCs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显
如表2显示，与对照组比较，模型组和丁苯酞低、中、 著升高（P＜0.05）；与模型组比较，丁苯酞低、中、高浓度
高浓度组 BMSCs 的存活率均显著降低（P＜0.05），其中 组BMSCs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低
模型组存活率最低；与模型组比较，丁苯酞低、中、高浓 （P＜0.05），且呈浓度依赖性，以丁苯酞高浓度组BMSCs
度组 BMSCs 的存活率均显著升高（P＜0.05），且呈浓度
培养液中的含量最低。
依赖性，以丁苯酞高浓度组BMSCs的存活率最高。
3.4 各组BMSCs中NF-κB p65 mRNA表达比较
3.2 各组BMSCs的凋亡率比较
如图2显示，与对照组比较，模型组和丁苯酞低、中、
如表 2、图 1 显示，与对照组比较，模型组和丁苯酞
高浓度组 BMSCs 中 NF-κB p65 mRNA 表达水平均显著
低、中、高浓度组 BMSCs 的凋亡率均显著升高（P＜
0.05），其中模型组凋亡率最高；与模型组比较，丁苯酞 升高（P＜0.05），其中模型组最高；与模型组比较，丁苯
低、中、高浓度组 BMSCs 的凋亡率均显著降低（P＜ 酞低、中、高浓度组BMSCs中NF-κB p65 mRNA表达水
0.05），且呈浓度依赖性，以丁苯酞高浓度组BMSCs的凋 平均显著降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性，以丁苯酞高
亡率最低。 浓度组NF-κB p65 mRNA表达水平最低。

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