Page 57 - 《中国药房》2023年8期
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marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作为治疗手段         分装或国产分析纯。
          已经成为脑卒中研究的热点。BMSCs 具有多向分化的                         1.3 实验动物
          能力，在特定条件下，可分化为神经细胞、胶质细胞、成                              2 月龄 SPF 级健康 Wistar 雄性大鼠，体质量 100～
                          [1]
          骨细胞等细胞类型 。然而，BMSCs 移植治疗脑卒中 2                       150 g，由海南省实验动物中心提供，生产许可证号为
          期临床试验指出，虽然 BMSCs 移植可以显著改善脑卒                        SCXK（琼）2019-0007。大鼠用颗粒饲料饲养，饲养环境
          中患者神经功能缺损症状，但是移植的细胞在体内存活                           的温度为 21～27 ℃，相对湿度为 40%～70%，明暗时长
                         [2]
          时间不超过1个月 。因此，通过抗氧化剂和凋亡抑制剂                          各为12 h。
          保护移植的BMSCs免受凋亡，提高其在炎性环境下的生                         2 实验方法
          存能力和存活率，可能是移植BMSCs治疗脑卒中成功的                         2.1 大鼠BMSCs的分离培养、鉴定及实验分组
                                                                                        [6]
          关键。                                                    参考本课题组以往的方法 ，在无菌条件下从大鼠
              丁苯酞具有减少炎症因子的释放、促进神经营养因                         股骨干和胫骨干提取 BMSCs，在恒温培养箱中培养，间
          子的分泌和血管新生以及抗氧化应激损伤等作用，广泛                           隔 2 d 更换培养基（DMEM 液体培养基+15% 胎牛血清+
          参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等一系列病理生理过                           0.5 mol/L谷氨酰胺，下同），置于显微镜下动态监测其生
          程 [3―4] 。丁苯酞可通过抑制Toll样受体4（Toll-like recep‐         长状态，连续传代培养 4～6 代冻存备用。特异性蛋白
          tor 4，TLR4）/核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号      CD29和CD44表达阳性表明成功提取到BMSCs。
          传导，下调肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，             2.2 分组与给药
                                                                              [4,7]
          TNF-α）、白细胞介素 18（interleukin 18，IL-18）和 IL-1β           参照文献方法 ，将实验分为对照组、模型组和丁
          等细胞因子的表达，抑制皮层和海马组织的星形胶质细                           苯酞低、中、高浓度组（10、20、50 μmol/L），除对照组外，
                                          [5]
          胞活化，减轻脑缺血再灌注炎性损伤 。但是丁苯酞对                           其余各组加入10 mg/L的脂多糖和相应浓度的丁苯酞。
          炎性损伤的 BMSCs 是否存在类似保护作用，尚未见报                        2.3 细胞存活率检测
          道。基于此，本实验研究丁苯酞对脂多糖诱导的BMSCs                             采用MTT比色法进行检测。取第4代BMSCs转至
          炎性损伤的作用及其可能的机制，为丁苯酞联合BMSCs                         96孔板，每孔100 μL含细胞1×10 个，细胞贴壁后24 h，
                                                                                          5
          移植治疗缺血性脑卒中、脊髓损伤或其他神经系统疾病                           更换培养基，按“2.2”项下方法分组、给药，每组 6 个复
          提供新的思路。                                            孔。培养24 h后，吸弃培养基，以磷酸盐缓冲液（PBS）清
          1 材料                                               洗3次，每孔加新鲜培养基100 μL、MTT（5.0 mg/mL）50
          1.1 主要仪器                                           μL，孵育4 h；离心弃上清液，再加入二甲基亚砜200 μL，
              本研究所用主要仪器包括 ELx800 型酶标仪（美国                     继续孵育到结晶全部溶解。以空白孔调零，采用酶标仪
          BioTek 公司），BX41 型荧光显微镜（日本 Olympus 公                测定 570 nm 波长处的吸光度（A），计算存活率，存活率
          司），TC-EA 型普通聚合酶链式反应（polymerase chain              （%）＝（实验组A值/对照组A值）×100%。
          reaction，PCR）扩增仪（杭州博日科技有限公司），EPS-                  2.4 细胞凋亡率检测
          600型数显式稳流电泳仪、VE-186型转移电泳槽、Tanon                        采用 Tunel 法进行检测。按照“2.3”项下方法取
          2500型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。                           BMSCs，培养、分组、给药，每组6个复孔。培养24 h后，
          1.2 主要药品与试剂                                        吸弃培养基，以 PBS 清洗 3 次，用 4% 多聚甲醛固定 30
              丁苯酞氯化钠注射液（批号 6182206125，规格 100                 min，1%过氧化氢作用20 min，Tunel反应液在37 ℃下培
          mL∶丁苯酞 25 mg 与氯化钠 0.9 g）购自石药集团恩必普                  育60 min，封片，置于荧光显微镜下观察记录，红色为凋
          药业有限公司；胎牛血清、DMEM 液体培养基、噻唑蓝                         亡细胞。各组均随机采集5个视野的细胞，尽可能保证
         （MTT，批号 M2128-1G）均购自美国 Sigma 公司；TNF-                视野下每张图含有相同的细胞数，计算细胞的凋亡率。
          α、IL-1β、IL-6 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号                 2.5 细胞炎症因子含量检测
          分别为20181118、20181005、20181018）均购自上海酶联                  采用 ELISA 法进行检测。取第 4 代的 BMSCs 转至
                                                                                         6
          生物科技有限公司；兔抗大鼠胱天蛋白酶3（caspase-3）、                    12孔板，每孔2 mL含细胞2×10 个，培养至细胞融合度
          B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相关X          为 60%～70% 时备用。按“2.2”项下方法分组、给药，每
          蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、NF-κB p65抗体及山      组6个复孔，培养24 h后，收集培养液，按试剂盒说明书
          羊抗兔 IgG 二抗（H&L）（货号分别为 184787、194583、               操作，使用酶标仪检测各组BMSCs培养液中TNF-α、IL-
          182734、194726、6721）均购自英国Abcam公司；甘油醛-3-             1β、IL-6的含量。
          磷酸脱氢酶（GAPDH，货号GB11002）购自武汉赛维尔生                     2.6 NF-κB p65 mRNA表达检测
          物科技有限公司；RNeasy Mini 试剂盒、一步法 RT-PCR                     采用 RT-PCR 法进行检测。按照“2.5”项下方法取
          试剂盒（货号分别为217004、210210）均购自德国Qiagen                 BMSCs，培养、分组、给药，每组 6 个复孔，培养 24 h 后，
          公司；一步法 Tunel 细胞凋亡检测试剂盒（货号 C1088）                   吸弃培养基，以PBS清洗3次，利用RNeasy Mini试剂盒
          购自上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为进口                           提取各组BMSCs的RNA，按照一步法RT-PCR试剂盒说


          中国药房  2023年第34卷第8期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 8    · 947 ·
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