Page 18 - 2021年17期
P. 18

酸化来调节糖脂的代谢平衡 。据文献报道，激活                              1 材料
                                    [3]
        AMPK不仅能降低患者的血糖水平，而且还对糖尿病并                           1.1 主要仪器
        发症（如糖尿病肾病、糖尿病心血管疾病等）具有潜在的                               本 研 究 所 用 主 要 仪 器 包 括 ：e2695 型 HPLC 仪 、
        治疗作用 。目前，临床上使用的 2 型糖尿病一线治疗                          XevoG2-XS 型 UPLC-Q-TOF/MS 仪（美国 Waters 公司），
                 [3]
        药物二甲双胍和噻唑烷二酮类药物吡格列酮等均被证                             JN300-2 型氮气吹扫仪（苏州吉米诺仪器有限公司），
        实为 AMPK 间接激动剂，虽有很好的降糖作用，但对糖                         AUW220D 型电子天平（日本 Shimadzu 公司），X1 型高
        尿病并发症的治疗效果有限             [4－5] ，加之迄今仍未有更具           速离心机（香港基因有限公司），HC-100 型恒温混匀仪
        特异性的 AMPK 直接激动剂上市，因此研发新型、高效                        （杭州佑宁仪器有限公司），DRHH-2型数显恒温水浴锅
        的AMPK直接激动剂具有重要的临床意义。                               （上海双捷实验设备有限公司）等。
            ZG02的化学名为6-苄氧基-9-（4-氯苯甲酰基）-四氢                   1.2 主要药品与试剂
        咔唑-3-羧酸（结构式见图 1A），是一个结构新颖的四氢                            LSM-13 原料药（批号 20201123，纯度＞99％）由本
        咔唑类降糖化合物，可通过激活 AMPK 通路来降低 db/                       课题组合成；吲哚美辛对照品（内标，批号 J0526A5，纯
                               [6]
        db 小鼠的血糖与血脂水平 。本课题组前期利用 ACD/                        度＞98％）购自大连美仑生物技术有限公司；烟酰胺腺
        Labs软件对该化合物进行初步类药性评估，发现其具有                          嘌呤二核苷酸磷酸二钠（NADP-Na2，批号1011L024）、葡
        较高的计算模拟值（CLogP＝5.75），但体内代谢不稳                        萄糖-6-磷酸-二钠（G-6-P-Na2，批号407H033）、葡萄糖-6-
        定。为了进一步寻找药动学性质更佳且降糖活性更优                             磷酸脱氢酶（G-6-P-DH，批号 20180725）均购自北京索
        的 AMPK 直接激动剂，本课题组前期以 ZG02 为先导化                      莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；氯化镁、柠檬
        合物设计合成了一系列衍生物，并通过葡萄糖消耗模型                            酸钠等其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
        筛选发现LSM-13{化学名为8-（苄氧基）-5-（4-氯苯甲酰                    1.3  大鼠肝微粒体
        基）-7-氟-1，3，4，5-四氢-2H-吡啶并[4，3-b]吲哚-2-羧酸                  雄性SD大鼠肝微粒体（批号MIC254034）购自武汉
        乙酯，结构式见图1B}能显著促进HepG2细胞对葡萄糖                         普莱特生物医药技术有限公司。
        的消耗，促葡萄糖消耗率达 44.78％，显著高于 ZG02                       2 方法与结果
        （P＜0.05）；同时，在动物体内实验中也证实了 LSM-13                     2.1  LSM-13定量分析的HPLC条件
        具有很好的降糖活性。可见，LSM-13 作为一个潜在的                             以 Waters XBridge C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）为色
        AMPK直接激动剂，具有进一步研发的价值。                               谱柱，以Waters Symmetry C18 VanGuard Cartidge（5 mm×
                                                            3.9 mm，5 μm）为保护柱，以乙腈（A）-0.1％甲酸溶液（B）
                                                            为流动相进行梯度洗脱（0～6 min，75％A；6～7.5 min，
                                                            75％ A→90％ A；7.5～13.5 min，90％ A；13.5～15 min，
                                                            90％A→75％A；15～16 min，75％A）；检测波长为 265
                                                            nm；流速为1 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为20 μL。
                  A. ZG02               B. LSM-13           2.2  代谢产物定性分析的UPLC-Q-TOF/MS条件
                  图1   ZG02与LSM-13的结构式                          以 Waters BEH C18 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱
               Fig 1  Structures of ZG02 and LSM-13         柱，以 0.01％甲酸溶液（A）-0.01％甲酸乙腈溶液（B）

            新药从发现到上市需要经过临床前研究、临床试                           为流动相进行梯度洗脱（0～1 min，95％A；1～5 min，
        验、报批和上市等4个阶段，其中药物代谢研究对前两个                           95％A→60％A；5～10 min，60％A→40％A；10～17 min，
                               [7]
        阶段具有重要的指导意义 。药物经过代谢可能使其活                            40％A→2％A；17～18 min，2％A；18～19 min，2％A→
        性丧失或者生成具有毒性的代谢产物，将直接影响药物                            95％A；19～20 min，95％A）；流速为 0.30 mL/min；柱温
                         [8]
        的有效性与安全性 。肝脏含有丰富的药物代谢酶系                             为35 ℃；进样量为5 μL；采集时间为20 min。离子源为
        统，是药物代谢和生物转化的主要器官，因此探讨药物                            电喷雾离子源（ESI）；扫描模式为正离子模式；毛细管电
        在肝脏中的稳定性及代谢情况显得尤为重要 。本研究                            压为 1.5 kV；离子源温度为 120 ℃；脱溶剂气温度为
                                               [9]
        采用体外肝微粒体温育法，以高效液相色谱法（HPLC）                          400 ℃；脱溶剂气流量为 800 L/h；锥孔气流量为 50 L/h；
        考察LSM-13在SD大鼠肝微粒体中的稳定性；采用超高                         扫描模式为“MSE continuum”模式；扫描范围为 m/z
        效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-                          50～1 200；碰撞能量为20～40 V。
        TOF/MS）并 根 据 二 级 质 谱 中 的 碎 片 离 子 信 息 推 测            2.3 溶液的制备
        LSM-13 在肝微粒体中的可能代谢产物，旨在初步探讨                         2.3.1 LSM-13 与内标贮备液         精密称取 LSM-13 原料
        该化合物在肝微粒体中的代谢规律，为后续 LSM-13 的                        药适量，以乙腈溶解并定容，混匀，制得质量浓度为 1
        体内代谢研究以及临床研究奠定基础。                                   mg/mL的LSM-13贮备液；精密称取内标对照品适量，同


        ·2060 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 17                                 中国药房    2021年第32卷第17期
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23