Page 19 - 2021年17期

法制得质量浓度为 1 mg/mL 的内标贮备液。两者均于 0.001 4
4 ℃保存，备用。临用前，取内标贮备液适量，以甲醇稀 0.001 2
0.001 0
释至质量浓度为0.5 μg/mL，备用。 0.000 8
0.000 6
2.3.2 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）辅 0.000 4
0.000 2
AU
酶溶液 分别称取 NADP-Na2 200 mg、G-6-P-Na2 200 0
－0.000 2
mg、氯化镁 133 mg，加水溶解并定容至 10 mL，混匀，得 －0.000 4
－0.000 6
A液；分别称取柠檬酸钠44 mg、G-6-P-DH 1 000 U（相当 －0.000 8
－0.001 0
于 1.36 mg），加水溶解并定容至 25 mL，混匀，得 B 液。 －0.001 2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
两者均于－20 ℃下保存，备用。临用前，将A、B液按体 t，min
A.空白溶剂
积比5 ∶ 1混合，得浓度为1 mmol/L（按反应产物NADPH
[10]
计）的辅酶溶液 。 0.012
2
2.4 样品的孵育与处理 0.010
0.008
2.4.1 孵育体系的建立 取大鼠肝微粒体，用pH 7.4的 1
0.006
磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至 5 mg/mL；取上述肝微粒体 AU
0.004
溶液 20 μL，加入“2.3.1”项下的 LSM-13 贮备液 2 μL 和
0.002
Tris-HCl 缓冲液 148 μL。将上述混合溶液置于 37 ℃水
0
浴锅中孵育5 min后，加入“2.3.2”项下的NADPH辅酶溶 －0.002
8
液 30 μL 以启动反应。该孵育体系的总体积为 200 μL， 0 2 4 6 t，min 10 12 14 16
其中 LSM-13 的质量浓度为 5 μg/mL，NADPH 的终浓度 B. LSM-13+内标
为1 mmol/L，有机溶剂体积分数不超过1％ 。 0.003 0
[11]
2.4.2 样品孵育与处理 将上述孵育体系继续置于 0.002 5
37 ℃水浴锅中，分别在孵育 0、5、10、15、20、30、45、60 0.002 0
0.001 5
min 时加入含 0.5 μg/mL 内标的乙腈 800 μL（温度 4 ℃） AU
0.001 0
以终止反应。将上述混合物涡旋混匀 1 min 后，于 4 ℃
0.000 5
下以 13 000 r/min 高速离心 10 min，收集上清液以氮气 0
流吹干，残渣用乙腈200 μL复溶，按“2.1”项下色谱条件 －0.000 5
进样分析。每个时间点的孵育样品平行3份操作。 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t，min
2.5 生物样品中LSM-13的定量分析方法学考察 C.空白孵育样品
2.5.1 专属性考察 分别取适量空白溶剂（乙腈）、
0.012 2
LSM-13+内标标准溶液（分别含 LSM-13 和内标 5、2
0.010
μg/mL，按“2.3.1”项下方法以乙腈配制）、空白孵育样品
0.008 1
（不含待测物和内标，按“2.4.2”项下方法孵育 15 min 制 0.006
得）、在大鼠肝微粒体孵育体系中孵育 15 min 时的孵育 AU 0.004
样品（按“2.4.2”项下方法孵育并处理所得），按“2.1”项下 0.002
色谱条件进样分析，记录色谱图（图 2）。结果，化合物 0
LSM-13的保留时间约为13.4 min，内标的保留时间约为 －0.002
0 2 4 6 8 10 12 14 16
7.1 min；两者可同时被检出且互不干扰，同时不受内源 t，min
D.孵育15 min样品
性物质的影响，提示该方法专属性良好。
注：1.内标；2. LSM-13
2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.3.1”项下的LSM-13 Note：1. internal standard；2. LSM-13
贮备液适量，加至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系 图2 LSM-13定量分析专属性试验的HPLC图
中，制得质量浓度为 0.5、1、2、5、10、20、40 μg/mL 的 Fig 2 HPLC chromatograms of specificity tests of
LSM-13 系列工作溶液，按“2.4.2”项下方法孵育 15 min LSM-13 quantitative analysis
并处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面 质量浓度的线性范围为 0.5～40 μg/mL，定量下限为 0.5
积。以 LSM-13 质量浓度为横坐标（x）、LSM-13 与内标 μg/mL。
的峰面积比值为纵坐标（y）作线性回归，得回归方程为 2.5.3 基质效应与提取回收率试验 精密量取“2.3.1”
2
y＝0.997 1x－0.526 6（R ＝0.999 1）。结果，LSM-13检测 项下的LSM-13贮备液适量，加入乙腈稀释，制得低、中、

中国药房 2021年第32卷第17期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 17 ·2061 ·