Page 21 - 《中国药房》2020年22期
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入不同质量浓度的生草乌培养液或诃子制草乌培养液 含或含1 µg/mL LPS的DMEM高糖培养基；加入量均为
（均用完全培养基稀释，下同），质量浓度均分别为 0.5、 100 μL。继续培养 24 h 后，取上清液，采用 ELISA 法以
1、2、4、6、8、10 mg/mL（以生药量计，给药浓度按预试验 酶标仪检测其中NO、TNF-α、IL-6的释放量，严格按相应
结果设置）；空白组细胞加入完全培养基；加入量均为 试剂盒说明书操作。试验重复3次。
100 μL。另设无细胞、无药物的调零组，每组设置3个复 2.5 统计学方法
孔。分别培养 4、8、12、24 h 后，各孔加入 CCK-8 试剂 10 采用 Graphpad 8.0、SPSS 22.0 软件对数据进行统计
μL，置于37 ℃、5％CO2的培养箱中孵育1 h。使用酶标仪 分析。计量资料均以x±s表示，多组间比较采用单因素
在450 nm波长处测定光密度（OD值）并计算细胞抑制率： 方差分析，两两比较采用 LSD 检验。P＜0.05 为差异有
细胞抑制率（％）＝[1－（给药组OD值－调零组OD值）/ 统计学意义。
（空白组OD值－调零组OD值）]×100％。试验重复3次。 3 结果
2.3.2 细胞形态 采用 Hoechst 33258 染色法观察。取 3.1 H9c2细胞抑制率的变化
对数生长期的 H9c2 细胞，按“2.3.1”项下方法调整细胞 当给药浓度为 0.5、1 mg/mL 时，生草乌和诃子制草
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密度为1×10 个/mL，接种于24孔板中，每孔500 μL。培 乌对 H9c2 细胞几乎均无抑制作用，个别时间点还表现
养24 h后，将细胞随机分为空白组和生草乌/诃子制草乌 出一定的促进生长作用；当质量浓度为 2 mg/mL 时，诃
不同浓度给药组，每组设置3个复孔。弃去上清液，各给 子制草乌在各时间点对H9c2细胞的抑制率均显著大于
药组细胞分别加入不同质量浓度（根据“2.3.1”CCK-8试 生草乌（P＜0.05 或 P＜0.01）；当质量浓度为 4、6、8、10
验结果选择对H9c2细胞有明显抑制作用的浓度为给药 mg/mL时，诃子制草乌在各时间点（除8、10 mg/mL作用
浓度）的生草乌培养液或诃子制草乌培养液；空白组细 24 h 外）对 H9c2 细胞的抑制率均显著低于生草乌（P＜
胞加入完全培养基；加入量均为 100 μL。继续培养 24 0.05或P＜0.01）。随着质量浓度的增加、作用时间的延
h，弃去培养基，用 PBS 洗涤 2 次；每孔加入 Hoechst 长，生草乌和诃子制草乌对 H9c2 细胞抑制作用的差异
33258 染色液 300 μL，避光孵育 20～30 min；弃去染色 有缩小的趋势。各组细胞不同作用时间的细胞抑制率
液，再用 PBS 洗涤 2 次。置于倒置显微镜下观察细胞 检测结果见图 1。参考上述结果，本研究将后续试验
形态。 生草乌和诃子制草乌的给药浓度分别均设置为 2、4、6
2.4 生草乌和诃子制草乌对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 mg/mL。
的影响 3.2 H9c2细胞形态学特征的变化
2.4.1 细胞存活率 采用CCK-8法检测。取RAW264.7 与空白组比较，当质量浓度为 2 mg/mL 时，生草乌
细胞，加入完全培养基适量，置于 37 ℃、5％CO2的培养 组细胞的荧光强度无明显变化，细胞核形态完整；诃子
箱中培养至对数生长期。取上述处于对数生长期的细 制草乌组细胞的荧光强度增强，但细胞核完整；当质量
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胞，用完全培养基调整细胞密度为 1×10 个/mL，接种于 浓度为4、6 mg/mL时，生草乌组和诃子制草乌组细胞的
96 孔板中，每孔 100 μL。培养 24 h 后，将细胞随机分为 荧光强度均明显增强且细胞核面积缩小，其中生草乌组
空白组和生草乌/诃子制草乌不同浓度给药组。弃去上 的荧光强度强于诃子制草乌组，且生草乌组的细胞核破
清液，各给药组细胞分别加入不同质量浓度的生草乌 碎现象更为严重，而诃子制草乌组的细胞核相对完整。
培养液或诃子制草乌培养液，质量浓度分别均为 0.05、 各组细胞形态学特征的荧光显微图见图2。
0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mg/mL（以生药量计，给药浓 3.3 RAW264.7细胞存活率的变化
度按预试验结果设置）；空白组细胞加入完全培养基；加 与空白组比较，生草乌质量浓度在 0.05～1 mg/mL
入量均为 100 μL。另设无细胞、无药物的调零组，每组 范围内对 RAW264.7 细胞无毒性，但达到 1.5 mg/mL 以
设置3个复孔。继续培养24 h后，各孔加入CCK-8试剂 后有明显的细胞毒性；诃子制草乌质量浓度在 0.05～
10 μL，按“2.3.1”项下方法处理后测定OD值并计算细胞 0.5 mg/mL 范围内对 RAW264.7 细胞无毒性，甚至有一
存活率：细胞存活率（％）＝（试验组 OD 值－调零组 OD 定的促增殖作用，但达到0.75 mg/mL以后有明显的细胞
值）/（空白组 OD 值－调零组 OD 值）×100％。细胞存活 毒性。各组细胞存活率的检测结果见图3。参考上述结
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率≥90％即为无毒 。试验重复3次。 果，本研究将后续试验生草乌和诃子制草乌的给药浓度
2.4.2 细胞中 NO、TNF-α、IL-6 的释放量 采用 ELISA 分别均设置为0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL。
法检测。取对数生长期的 RAW264.7 细胞，按“2.4.1”项 3.4 RAW264.7细胞中NO、TNF-α、IL-6释放量的变化
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下方法调整细胞密度为1×10 个/mL，接种于96孔板中， 与空白组比较，模型组细胞中NO、TNF-α、IL-6的释
每孔 100 μL。培养 24 h 后，将细胞随机分为空白组、模 放量均显著升高（P＜0.01），提示造模成功。与模型组
型组和生草乌/诃子制草乌不同浓度给药组，每组设置3 比较，0.25、0.5 mg/mL 生草乌组细胞中 NO 的释放量，
个复孔。弃去上清液，各给药组细胞分别加入含1 µg/mL 0.1、0.25、0.5 mg/mL 诃子制草乌组细胞中 NO 的释放量
LPS和不同质量浓度（根据“2.4.1”CCK-8试验结果选择 以及 0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL 生草乌组和诃子制草乌
对 RAW264.7 细胞无毒性的浓度为给药浓度）生草乌培 组细胞中 TNF-α、IL-6 的释放量均显著降低（P＜0.05 或
养液或诃子制草乌培养液；空白组和模型组细胞加入不 P＜0.01）。其中，诃子制草乌对NO释放量的抑制作用优
中国药房 2020年第31卷第22期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22 ·2703 ·
