Page 23 - 2019年10月第30卷第19期

2.5 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测心肌组织 后脏器情况较模型组严重程度减轻；HBSP 组大鼠未出
中PI3K和Akt mRNA表达 现死亡情况。比较各组大鼠解剖前体质量发现，与对照
大鼠处死后，分离心肌组织，称取60 mg左右的心肌 组比较，模型组大鼠体质量显著降低，差异有统计学意
组织加入 1 mL Trizol，严格按照总 RNA 提取试剂盒、逆 义（P＜0.05）；与模型组比较，EPO 组和 HBSP 组大鼠体
转录试剂盒提取心肌总 RNA，逆转录合成 cDNA，再以 质量显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；EPO组与
cDNA 为模板进行 PCR 扩增。以 GAPDH 为内参，分别 HBSP 组大鼠间体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。
对 PI3K 和 Akt 基因进行扩增。反应条件：94 ℃ 5 min； 各组大鼠解剖前的体质量结果见表2。
94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 15 s，35 个循环；72 ℃ 7 表2 各组大鼠解剖前的体质量结果（x±±s，g）
min。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用凝胶 Fig 2 Body weight results of rats before anatomy in
成像系统Image Lab进行条带图像采集，使用Image J软 each group（x±±s，g）
件分析条带吸光度。引物序列与产物长度见表1。 组别 n 体质量
表1 引物序列与产物长度 对照组 10 474.66±17.89
模型组 8 334.25±15.38 ＊
Tab 1 Primer sequence and product length EPO组 9 378.99±15.26 #
基因 引物序列（5′-3′） 长度，bp HBSP组 10 384.50±8.98 #
PI3K 上游：GCAGGCAGCCTGTCTTCCATG 81 注：与对照组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
#
＊
下游：TTCCGGTGTCTTGCTGATGCG Note：vs. control group，P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
＊
#
Akt 上游：GGCAGGAGGAGGAGACGATGG 109
下游：TTCATGGTCACACGGTGCTTGG 3.2 大鼠的心功能指标变化
GAPDH 上游：CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC 102 与对照组比较，模型组大鼠的LVIDd显著延长，EF、
下游：CCCAATACGACCAAATCCGTT
FS及CO显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与
2.6 Western blot 法检测心肌组织中 p-PI3K 和 p-Akt
模型组比较，EPO 组和 HBSP 组大鼠的 LVIDd 显著缩
蛋白表达 短，EF、FS 及 CO 显著增加，差异均有统计学意义（P＜
称取60 mg左右大鼠心肌组织，充分剪碎研磨，加入
0.05）。EPO 组与 HBSP 组大鼠间心功能指标比较差异
100 μL 的细胞裂解液，以 12 000 r/min（离心半径为 8
均无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠的心功能指标结
cm）离心20 min，取上清液即为蛋白样本。按5×上样缓
果见表3。
冲液的比例加入蛋白样品及缓冲液充分混匀，99 ℃加热
表3 各组大鼠心功能指标结果（x±±s）
变性 10 min，再以 10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 Tab 3 Cardiac function results of rats in each group
胶 电 泳（SDS-PAGE）分 离 蛋 白 后 ，将 蛋 白 电 转 移 至
（x±±s）
PVDF 膜上。经 5％脱脂奶粉封闭后，滴加抗磷酸化
组别 n LVIDd，cm EF，％ FS，％ CO，L/min
p-PI3K 单克隆抗体和 p-Akt 单克隆抗体（稀释比例均为 对照组 10 0.593±0.027 86.15±7.708 48.68±2.035 4.761±1.238
1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜，再滴加辣根过氧化物酶标记山 模型组 8 0.765±0.048 ＊ 67.14±3.092 ＊ 34.72±1.314 ＊ 2.564±0.765 ＊
EPO组 9 0.621±0.035 # 80.18±4.283 # 40.48±1.097 # 3.976±1.092 #
羊抗兔二抗（稀释比例为 1 ∶ 20 000），常温孵育 1 h，经
HBSP组 10 0.641±0.019 # 83.29±6.276 # 42.96±1.260 # 4.123±1.207 #
ECL发光试剂曝光后观察结果。采用Image J软件分析 注：与对照组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
#
＊
条带的光密度值，以GAPDH为内参，以目的蛋白与内参 Note：vs. control group，P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
＊
#
的光密度比值表示相应蛋白的表达水平。 3.3 大鼠血清中cTnI、NT-proBNP含量变化
2.7 统计学分析 与对照组比较，模型组大鼠血清中cTnI和NT-proB-
采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，定量资料采用 NP 含量均显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较 与模型组比较，EPO 和 HBSP 组大鼠血清中 cTnI 和
采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。 NT-proBNP含量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜
3 结果 0.05）。与 EPO 组比较，HBSP 组大鼠血清中 cTnI 和
3.1 大鼠的一般情况 NT-proBNP含量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜
与对照组比较，模型组大鼠饮水和鼠粮摄入量减 0.05）。各组大鼠血清中 cTnI、NT-proBNP 含量测定结
少，并且出现精神差、活动减少、毛发脏乱、脱毛、消瘦等 果见表4。
表现，部分大鼠后期处于濒死状态，于实验第9周死亡2 3.4 大鼠心肌组织中PI3K、Akt mRNA表达变化
只，解剖后发现大鼠出现胸腔、腹腔积液，心脏肥大，肝 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中PI3K及Akt
肾暗红肿胀。EPO组和HBSP组大鼠一般情况较模型组 mRNA 表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜
好转，其中 EPO 组大鼠于实验第 10 周死亡 1 只，其解剖 0.05）。与模型组比较，EPO组和HBSP组大鼠心肌组织

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