Page 27 - 《中国药房》2026年4期
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1.3 实验细胞与动物 和模型组大鼠分别灌胃等体积生理盐水。每天给药 1
人乳腺癌细胞MCF-7（批号HT-X1646）购自深圳市 次，连续14 d。
豪地华拓生物科技有限公司。 2.4 体重及肿瘤体积检测
7～8周龄雌性SPF级SD大鼠97只[生产许可证号： 分别于给药前及末次给药后称定各组大鼠的体重；
SCXK（鄂）2022-0029]购自武汉贝赛模式生物科技有限 于末次给药后第2天，将各组大鼠麻醉、处死并暴露带有
公司。动物饲养于温度（25±2）℃、相对湿度 50%～ 转移肿瘤的胫骨，以游标卡尺测量其瘤组织长短径，计
55%、每 12 h 光照/黑暗交替的干燥清洁级动物房内，自 算肿瘤体积（体积＝长径×短径×短径/2）。
由摄食、饮水。本研究方案已通过武汉贝赛模式生物科 2.5 机械性痛阈值和热痛阈值检测
技有限公司动物伦理委员会审批[编号：BSMS动（福）第 末次给药并称定体重后，将各组大鼠置于金属网
2024-12-1237A号]。 上，罩上有机玻璃限制其活动，待大鼠安静后，以探针刺
2 方法 激其右侧足底中心，共 10 次（5 次/min，每次间隔 10 s），
2.1 药液制备 分析每次测量峰值，取平均值，即为大鼠机械性痛阈值。
[6]
根据阳和汤加减的组成，按相关文献 方法制备药 随后，将各组大鼠置于55 ℃恒温板上，记录从放入到舔
液：取灵芝、骨碎补、生晒参、白术、鹿角胶（烊化）、茯苓、 右后肢的时间，共 3 次（每次间隔 10 min，热刺激不超过
桂枝、白芥子、甘草、麻黄、全蝎饮片（质量比10∶10∶9∶9∶ 30 s），取平均值，即为大鼠热痛阈值。
9∶9∶6∶6∶6∶3∶3），混合，加7～8倍量水，浸泡、煎煮各30 2.6 胫骨骨破坏面积占比分析
min，过滤；药渣再加 4～5 倍量水，煎煮 30 min，过滤；合 检测机械性痛阈值及热痛阈值后，将各组大鼠麻醉
并 2 次滤液，浓缩成每 1 mL 含生药 0.013、0.026、0.052 g 并将其右后肢固定在 CT 仪载物台上，以 10 μm 分辨率
的药液，备用。 进行360 °扫描，并进行三维重建，观察、分析大鼠胫骨骨
2.2 细胞培养 破坏面积占比（胫骨骨破坏面积占比＝胫骨骨破坏面积/
将 MCF-7 细胞置于 DMEM 培养基（含 10% 胎牛血 胫骨总面积×100%）。
清、1%青-链霉素双抗）中，于37 ℃、5%CO2条件下培养， 2.7 胫骨组织病理观察
每 2 d 更换培养基 1 次，待细胞融合度达 90% 左右进行 检测肿瘤体积后，每组任选 6 只大鼠的右后肢胫骨
消化传代，取对数期细胞进行后续研究。 组织，以 4% 甲醛溶液固定，经脱钙脱水、浸蜡包埋后制
2.3 造模、分组与给药 作石蜡切片；取切片，经脱蜡至水、二甲苯透明、脱水后，
[7]
参考相关文献 方法构建乳腺癌骨转移大鼠模型： 进行HE染色；清洗后，经干燥、透明后密封，使用显微镜
取大鼠 85 只，以戊巴比妥钠麻醉，再将其膝关节屈曲 观察大鼠胫骨组织的病理学变化。
90 °后固定于操作台上，以确定胫骨平台位置；消毒其右 2.8 胫骨组织破骨细胞观察
后肢皮肤，用 26 G 显微注射器吸取 1×10 个/mL 的 取“2.7”项下各组大鼠胫骨组织石蜡切片，经脱蜡至
7
MCF-7 乳腺癌细胞悬液（以磷酸盐缓冲液为溶剂）10 水后，加入 TRAP 染色液适量，于 37 ℃下避光孵育 70
μL，从胫骨近端斜下向胫骨远端缓慢旋转刺入骨髓腔 min；以流水冲洗后，加入苏木精染色；经脱水、透明后密
（至针尖有落空感），缓慢注入细胞悬液并停留1 min后， 封，使用显微镜观察并记录破骨细胞（呈酒红色）数量。
退针并局部压迫；将大鼠置于37 ℃恒温板上，待苏醒后 2.9 胫骨组织中RANK、RANKL蛋白阳性表达检测
再放回笼中（任选3只进行检测，若其出现体重下降、精 采用免疫组化法检测。取“2.7”项下各组大鼠胫骨
神萎靡、毛色暗淡、伴患肢运动障碍等症状，机械性痛阈 组织石蜡切片，经脱蜡至水后，进行抗原修复及灭活处
值及热痛阈值较正常大鼠显著下降，CT 扫描可见胫骨 理，再以脱脂奶粉密封；加入RANK、RANKL一抗（稀释
[7]
骨破坏，则提示造模成功 ）。另取健康大鼠12只，仅向 比例均为 1∶100），于 4 ℃下孵育；次日，加入相应二抗
其骨髓腔内注射磷酸盐缓冲液10 μL，作为对照组。 （稀释比例为 1∶500），于 37 ℃下孵育 1 h；经 DAB 显影、
造模成功的大鼠共 75 只。除用于模型验证的 3 只 苏木精复染后漂洗，使用显微镜观察并分析上述蛋白阳
外，将余下的72只随机分为模型组，阳和汤加减低、中、 性表达区域（呈棕黄色或褐色）的平均光密度，以反映对
高剂量组，阳和汤加减高剂量+si-NC 组，阳和汤加减高 应蛋白的阳性表达水平。
剂量+si-RIPK1 组，每组 12 只。阳和汤加减低、中、高剂 2.10 胫骨组织中 RIPK1/RIPK3 通路相关蛋白表达
量组大鼠分别灌胃相应药液 1.30、2.60、5.20 g/kg（体积 检测
为20 mL，按生药量计，根据前期预实验结果设置）；阳和 采用 Western blot 法检测。取每组剩余 6 只大鼠的
汤加减高剂量+si-NC 组、阳和汤加减高剂量+si-RIPK1 胫骨组织，进行蛋白裂解以提取总蛋白；定量后，于沸水
组大鼠在灌胃相应药液5.20 g/kg（体积为20 mL，按生药 浴中加热变性。取变性蛋白适量，经凝胶电泳分离后转
量计）的同时，分别尾静脉注射 si-NC、si-RIPK1 溶液 25 移至聚偏二氟乙烯膜上，以脱脂奶粉封闭；洗膜后，加入
nmol/kg（体积为100 μL，以配套缓冲液为溶剂）；对照组 p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL、
中国药房 2026年第37卷第4期 China Pharmacy 2026 Vol. 37 No. 4 · 433 ·
