Page 43 - 《中国药房》2026年3期

表3 各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10水平比较 较，LPS 组、miR-345-3p 阴性对照组细胞中 Akt1、PI3K、
（x±s，n＝6，pg/mL） HIF-1α 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与 LPS 组
组别 TNF-α IL-1β IL-10 比较，miR-345-3p 模拟物组细胞中 Akt1、PI3K、HIF-1α
对照组 67.55±20.58 51.68±7.16 102.54±10.77 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。
LPS组 156.96±11.66 a 99.10±11.55 a 76.18±8.90 a
miR-345-3p阴性对照组 156.92±13.45 a 97.23±10.40 a 78.63±12.43 a HIF-1α 120 kDa
miR-345-3p模拟物组 80.40±12.53 b 63.45±10.13 b 117.14±7.44 b
PI3K 85 kDa
a：与对照组比较，P＜0.01；b：与LPS组比较，P＜0.01。
2.3.3 细胞中Akt1、PI3K、HIF-1α的mRNA表达检测 Akt1 60 kDa
取对数生长期的 BEAS-2B 细胞，按“2.3.1”项下方 GAPDH 36 kDa
法分组、处理后（每组设3个复孔），收集各组细胞，提取 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
细胞中总RNA，将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模 Ⅰ：对照组；Ⅱ：LPS组；Ⅲ：miR-345-3p阴性对照组；Ⅳ：miR-345-
板进行 PCR 扩增，扩增条件为：90 ℃预变性 20 min； 3p模拟物组。
95 ℃变性 15 s，55～60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 1 min，共 图5 各组细胞中 Akt1、PI3K、HIF-1α 蛋白表达的电
[20]
40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2 －ΔΔCt 法 计算 泳图
Akt1、PI3K、HIF-1α 的 mRNA 表达水平。PCR 引物由生 表6 各组细胞中Akt1、PI3K、HIF-1α蛋白表达水平比
工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，具体引物 较（x±s，n＝3）
序列及扩增产物长度见表4。结果（表5）显示，与对照组 组别 Akt1 PI3K HIF-1α
对照组 0.50±0.09 0.65±0.08 0.48±0.13
比 较 ，LPS 组 、miR-345-3p 阴 性 对 照 组 细 胞 中 Akt1、
LPS组 1.08±0.13 a 1.09±0.08 a 0.99±0.08 a
PI3K、HIF-1α的mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01）； miR-345-3p阴性对照组 1.11±0.12 a 1.00±0.04 a 1.01±0.11 a
与LPS组比较，miR-345-3p模拟物组细胞中Akt1、PI3K、 miR-345-3p模拟物组 0.65±0.15 b 0.65±0.01 b 0.54±0.10 b
HIF-1α的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）。 a：与对照组比较，P＜0.01；b：与LPS组比较，P＜0.01。
表4 PCR引物序列及扩增产物长度 3 讨论
基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp 研究发现，肺部疾病患者血清中外泌体总体水平发
GAPDH 上游：ACACCCACTCCTCCACCTTTG 112 生改变 ，外泌体携带的miRNA也被证实在肺部疾病的
[9]
下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTAG [21]
Akt1 上游：CACTGTCATCGAACGCACCTTC 116 发生发展过程中发挥重要作用 。连翘和金银花配伍
下游：AGTCCATCTCCTCCTCCTCCTG 具有协同作用，可增强清热解毒的功效和抗炎效能，临
HIF-1α 上游：GTTCCGCAAGCCCTGAAAGC 113 床上常将两者配伍用于治疗 ALI 等肺部疾病 。然而，
[22]
下游：TCATCAGTGGTGGCAGTGGTAG
PI3K 上游：CGGTGACTGTGTGGGACTTATTGAG 111 连翘-金银花药对是否可通过调控外泌体miRNA表达发
下游：TGTAGTGTGTGGCTGTTGAACTGC 挥改善ALI的作用尚不明确。本研究药效学结果显示，
表5 各组细胞中Akt1、PI3K、HIF-1α的mRNA表达水 经连翘-金银花药对干预后，ALI大鼠BALF中促炎因子
平比较（x±s，n＝3） TNF-α、IL-1β 水平降低，抗炎因子 IL-10 水平升高。在
组别 Akt1 PI3K HIF-1α 此药效结果的基础上，为深入揭示其作用机制，本研究
对照组 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.08 采用高通量测序技术筛选了连翘-金银花药对干预后
LPS组 7.15±0.49 a 1.78±0.27 a 1.72±0.14 a ALI 大鼠血清外泌体中差异表达的 miRNA，结果显示，
miR-345-3p阴性对照组 6.18±0.71 a 1.77±0.10 a 1.89±0.22 a
miR-345-3p模拟物组 0.77±0.07 b 1.16±0.08 b 1.01±0.10 b miR-345-3p、miR-194-5p、miR-653-5p 等在连翘-金银花
a：与对照组比较，P＜0.01；b：与LPS组比较，P＜0.01。 药对组大鼠血清外泌体中显著上调。结合文献[15―16]
2.3.4 细胞中Akt1、PI3K、HIF-1α蛋白表达检测 发现，miR-345-3p 与炎症反应密切相关。进一步通过
取对数生长期的 BEAS-2B 细胞，按“2.3.1”项下方 KEGG 富集分析发现，差异表达 miRNA 的靶基因涉及
法分组、处理后（每组设3个复孔），收集各组细胞，加入 的 KEGG 通路包括轴突导向信号通路、钙信号通路和
RIPA裂解液裂解30 min，离心取上清液；经BCA法测定 HIF-1信号通路。研究发现，HIF-α作为HIF的核心亚基，
蛋白浓度后，将蛋白进行变性处理。取变性蛋白上样进 能够通过上游分子 PI3K 和 Akt1 的信号传导实现 HIF-1
行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；经转膜、封闭 途径的激活，从而在 ALI 的发生发展中发挥作用 [23―24] 。
后，加入 GAPDH、Akt1、PI3K、HIF-1α 一抗（稀释度分别 由此推测，HIF-1信号通路可能是连翘-金银花药对调控
为 1∶4 000、1∶4 000、1∶2 000、1∶3 000），4 ℃孵育过夜； 血清外泌体miRNA发挥改善ALI的重要作用通路。
洗膜，加入二抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育1 h；经显 基于此，本研究通过构建 ALI 细胞模型，并转染
影处理后，利用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目 miR-345-3p模拟物（模拟miR-345-3p过表达），以验证上
的蛋白与内参（GAPDH）蛋白条带的灰度值比值表示目 述推测。结果发现，与 LPS 组比较，miR-345-3p 模拟物
的蛋白的表达水平。结果（图5、表6）显示，与对照组比 组细胞上清液中 TNF-α、IL-1β 水平和细胞中 Akt1、

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