Page 47 - 《中国药房》2026年3期
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1.3 细胞                                             500），室温孵育过夜；采用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂
              大鼠肝星状细胞系 HSC-T6（货号 TCR-C627）购自                 避光孵育 5 min 后，置于荧光显微镜下观察并采集图像
          苏州海星生物科技有限公司。                                     （阳性细胞呈明亮、清晰的绿色纤维状或束状荧光，与蓝
          2 实验方法                                             色细胞核形成明显共定位）。采用Image J软件分析细胞
          2.1 细胞培养                                           中α-SMA蛋白的荧光强度。荧光强度越强，表明蛋白表
              将 HSC-T6 细胞接种于含 10% 胎牛血清及 1% 青霉                达水平越高。
          素-链霉素双抗的 DMEM 培养基中，然后置于 37 ℃、                      2.6 细胞中miRNA-204/NUAK1/Hippo信号轴活性考察
          5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞融合度                             采用细胞转染法进行考察。将处于对数生长期的
          为80%时进行传代等后续处理。                                    HSC-T6细胞接种于24孔板中，分为miRNA-204模拟物
          2.2 细胞分组、造模与给药                                     组、miRNA-204 模拟物阴性对照组、miRNA-204 抑制剂
              将细胞分为对照组、模型组（TGF-β，5 ng/mL）、TFCTL              组、miRNA-204 抑制剂阴性对照组，每组设 3 个复孔。
          低浓度组（20 μg/mL）、TFCTL 中浓度组（40 μg/mL）、               各组细胞加入相应转染试剂（模拟物及其阴性对照转染
          TFCTL高浓度组（60 μg/mL）。除对照组外，其余各组均                    试剂的终浓度均为 50 nmol/L，抑制剂及其阴性对照转
                                          [14]
          加入 5 ng/mL 的 TGF-β 诱导 HSC 活化 。培养 24 h 后，           染试剂的终浓度均为 100 nmol/L，上述浓度均根据试剂
          TFCTL各浓度组加入相应药液（浓度根据本课题组前期                         盒要求设置），室温孵育15 min后，将培养基更换成不含
          研究结果设置），对照组和模型组加入等体积培养基，培                          1%青霉素-链霉素双抗的培养基，继续培养48 h后进行
          养24 h后进行后续研究。                                      相关实验（笔者利用PCR实验验证了各组细胞的转染效
          2.3 细胞凋亡情况检测                                       率，结果显示均转染成功）。（1）基因层面的考察：取上述
                                                             培养 48 h 后的各组细胞适量，提取细胞中总 RNA，再将
              将处于对数生长期的 HSC-T6 细胞接种于 6 孔板
                                                             RNA 反转录为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩
          中，然后按“2.2”项下方法分组、造模与给药，每组设3个
                                                             增。PCR扩增体系为：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，
          复孔。培养 24 h 后，收集各组细胞沉淀，以磷酸盐缓冲
                                                             50×Rox Reference Dye 0.4 μL，正、反向引物各 0.6 μL，
          液（PBS）洗涤2次，根据Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测
                                                             cDNA 模板 2 μL，无酶水 6.4 μL。PCR 扩增程序为：
          试剂盒说明书方法操作，再采用流式细胞仪检测 HSC-
                                                             95 ℃预变性 15 min；94 ℃变性 20 s，60 ℃退火/延伸 34
          T6细胞的凋亡情况，并计算细胞凋亡率（细胞凋亡率＝
                                                             s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2              －ΔΔCt 法对目的
          凋亡细胞数/细胞总数×100%）。
                                                             基因进行定量分析。PCR 引物由生工生物工程（上海）
          2.4 细胞中 α-SMA、Collagen Ⅰ及 Hippo/YAP 通路相
                                                             股份有限公司设计并合成，具体引物序列及扩增产物长
          关蛋白表达检测
                                                             度见表 1。（2）蛋白层面的考察：按“2.4”项下方法，检测
              将处于对数生长期的 HSC-T6 细胞接种于 6 孔板
                                                             转 染 后 细 胞 中 α -SMA、Collagen  Ⅰ 和 miRNA-204/
          中，然后按“2.2”项下方法分组、造模与给药，每组设3个
                                                             NUAK1/Hippo 信 号 轴 相 关 蛋 白 YAP、MST1、LATS1、
          复孔。培养24 h后，收集各组细胞，提取细胞中总蛋白，
                                                             NUAK1的表达水平。其中，NUAK1的稀释度为1∶500，
          经 BCA 法测定蛋白浓度后，进行变性处理。取变性后
                                                             其余条件均同“2.4”项下。
          蛋白样品适量，上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺
                                                                     表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          凝胶电泳，经转膜、封闭后，加入 α-SMA、Collagen Ⅰ、
                                                              基因             正向引物（5′→3′）              反向引物（5′→3′）  扩增产物长度/bp
          YAP、MST1、LATS1、GAPDH 一抗（稀释度分别为 1∶
                                                              α-SMA  TGTGCTGGACTCTGGAGATG  GATCACCTGCCCATCAGG  102
          5 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000），于   Collagen Ⅰ TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG  GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC  129
          4 ℃下孵育过夜；次日，以TBST洗膜3次，加入二抗（稀释                       YAP  CCCTTTCTTAACAGTGGCACCTATC TGCTCTGGCTGATGGTGTCTC  112
                                                              MST1  GAACAGTATCGTGGCTCAGTCAG ATTGTGGCTTATGTGGTGTCTCTG    94
          度为1∶10 000），室温孵育1 h；以TBST洗膜3次，经显影
                                                              LATS1  TGCACTGGCTTCAGATGGAC  CACACCGACAGTTGGAAGGA  108
          成像后，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的                        NUAK1  TTTTCAGGCCGAGTGGTTGC  TCGTCTGATGTGAACCATGTCT  150
          蛋白与内参（GAPDH）蛋白条带的灰度值比值表示目的                          GAPDH  TGTGAACGGATTTGGCCGTA  ACTGTGCCGTTGAATTTGCC  173
          蛋白的表达水平。                                           2.7 统计学方法
          2.5 细胞中活化标志物α-SMA蛋白的荧光表达检测                             利用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。数据以
              将处于对数生长期的 HSC-T6 细胞接种于 12 孔板                   x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          中，然后按“2.2”项下方法分组、造模与给药，每组设3个                       比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          复孔。培养 24 h 后，用 4% 多聚甲醛固定 15 min，以                  3 结果
          0.1% Triton X-100 透化 6 min，经 5% 牛血清白蛋白封闭           3.1 TFCTL对细胞凋亡的影响
          30 min后，加入α-SMA一抗（稀释度为1∶100），于4 ℃下                     与对照组[细胞凋亡率为（9.08±0.62）%]比较，模型
          孵育过夜；以 PBS 清洗 5 次后，加入二抗（稀释度为 1∶                    组细胞凋亡率[（9.04±0.58）%]差异无统计学意义（P＞


          中国药房  2026年第37卷第3期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 3    · 313 ·
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