Page 42 - 《中国药房》2026年3期

用 NovaSeq 型高通量基因测序仪基于双端测序策略进 de/rnahybrid）对外泌体中差异表达的 miRNA 进行靶基
行测序。将各组血清外泌体的 miRNA 进行两两比较， 因预测，然后将2个数据库预测结果取交集，即得差异表
再利用差异表达倍数（fold change，FC）和差异显著性 P 达 miRNA 的靶基因；利用 DAVID 数据库对靶基因进行
值（|log2FC|＞1，P＜0.05）筛选差异表达 miRNA。结果 KEGG 富集分析，再利用超几何分布算法 分析具有显
[17]
（图3）显示，与空白组比较，模型组大鼠血清外泌体中差 著性（P＜0.05）的通路，并将排名前 10 位的通路进行可
异表达 miRNA 共 53 个（43 个上调、10 个下调）；与模型 视化展示。结果（图4）显示，差异表达miRNA的靶基因
组比较，连翘-金银花药对组大鼠血清外泌体中差异表 涉及的 KEGG 通路包括轴突导向（axon guidance）信号
达 miRNA 共 55 个（20 个上调、35 个下调）。其中，31 个 通路、钙信号通路（calcium signaling pathway）和 HIF-1
miRNA 在造模后出现表达差异，而在连翘-金银花药对
信号通路（HIF-1 signaling pathway）等。基于相关研究
干预后又出现反向表达趋势，提示这 31 个 miRNA 可能 [18]
报道 和 KEGG 富集分析结果，本研究选择 HIF-1 信号
为连翘-金银花药对干预 ALI 的潜在靶点。进一步对这
通路进行后续验证。
31 个 miRNA 进行分析发现，连翘-金银花药对干预后，
大鼠血清外泌体中显著上调的 miRNA 有 miR-345-3p、 axon guidance
miR-194-5p、miR-653-5p 等（具体信息可扫描本文首页 long-term potentiation
基因数
二维码查看“增强出版”板块中的附表 1）。结合相关研 oxytocin signaling pathway 63
究 [15―16] 发现，miR-345-3p 与炎症反应密切相关，提示其 circadian entrainment 106
可能是连翘-金银花药对干预ALI的重要靶点。 viral life cycle - HIV-1
251
P
calcium signaling pathway
0.006
glioma
0.004
7.5 HIF-1 signaling pathway
0.002
melanogenesis
类型 serotonergic synapse
5.0 升高 2.00 2.66 3.32 3.98 4.64 5.30
降低
－log 10 P 非差异表达 富集评分

2.5 图4 差异表达miRNA的靶基因涉及的KEGG通路
2.3 体外机制验证实验
2.3.1 细胞分组与处理
0
将 BEAS-2B 细胞接种于含 10% 胎牛血清和抗生素
－10 －5 0 5 10
log 2 FC 的 DMEM 培养基中，培养至对数生长期时进行后续实
A.空白组 vs. 模型组 5
8 验。取对数生长期的BEAS-2B细胞，按2×10 个/孔接种
于 6 孔板中，然后随机分为对照组、LPS 组、miR-345-3p
阴性对照组、miR-345-3p模拟物组。miR-345-3p阴性对
6
照组和 miR-345-3p 模拟物组细胞分别转染 100 pmol 的
miR345-3p 阴性试剂与 miR-345-3p 模拟物（对照组和
类型
4 升高 LPS 组以等体积培养基代替）；培养 24 h 后，除对照组
降低
－log 10 P 非差异表达 外，其余各组均加入 10 µg/mL 的 LPS 培养 6 h，以复制
[19]
ALI细胞模型。
2
2.3.2 细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10水平检测
取对数生长期的 BEAS-2B 细胞，按“2.3.1”项下方
0
法分组、处理后（每组设 6 个复孔），收集各组细胞上清
－10 －5 0 5 10
log 2 FC 液。根据试剂盒说明书方法操作，检测细胞上清液中炎
B.模型组 vs. 连翘-金银花药对组 症因子 TNF-α、IL-1β、IL-10 水平。结果（表 3）显示，与
图3 各组大鼠血清外泌体中差异表达miRNA的火山图
对照组比较，LPS 组、miR-345-3p 阴性对照组细胞上清

2.2.3 富集分析 液中 TNF-α、IL-1β 水平均显著升高（P＜0.01），IL-10 水
采用 miRanda 数据库（https：//www.bioinformatics. 平均显著降低（P＜0.01）；与 LPS 组比较，miR-345-3p 模
com. cn/local_miranda_miRNA_target_prediction_120）和 拟物组细胞上清液中 TNF-α、IL-1β 水平均显著降低
RNAhybrid 数据库（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld. （P＜0.01），IL-10水平显著升高（P＜0.01）。

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