Page 35 - 《中国药房》2026年3期
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AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、SREBP-1、GPAT、β-肌              37 ℃、5%CO2 恒温培养箱中培养。待细胞融合度达
          动蛋白（β-actin）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山                      80%～90%时，进行传代或铺板操作。
          羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号分别为 BB07045674、                    2.4 细胞分组、造模与给药
          BB08185715、BB09304011、BB06297006、AH11286403、           将 L02 细胞以 5×10 个/孔接种于 24 孔板中（或以
                                                                                   4
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          BA12163708）均购自北京博奥森生物技术有限公司。                       1.4×10 个/孔接种于 6 孔板中），然后分为对照组、模型
          1.3 实验动物                                           组、辛伐他汀含药血清组、BYHWD 含药血清组、CC 含
              本研究所用动物为健康清洁级雄性 SD 大鼠，共 42                     药血清组、30YC 含药血清组、50YC 含药血清组、75YC
          只，体重（200±20） g，购自辽宁长生生物技术股份有限                      含药血清组，每组设3个复孔。除对照组外，其余各组细
          公司，实验动物生产许可证号为 SCXK（辽）2020-0001。                   胞均加入0.2 mol/L油酸诱导24 h，以建立脂质沉积模型
          本研究中动物实验已获黑龙江中医药大学实验动物伦                           （以模拟 NAFLD 的病理状态）；各组再加入相应 20% 含
          理委员会批准，伦理审查批号为2024053104。                          药血清/空白血清干预24 h。
          1.4 细胞                                             2.5 细胞中脂质沉积情况观察
              人L02肝细胞购自大连美仑生物技术有限公司。                             将 L02 细胞按“2.4”项下方法分组、造模与给药（接
          2 方法                                               种于24孔板中），干预24 h后，收集细胞。以磷酸盐缓冲
          2.1 BYHWD及其有效部位的制备                                 液清洗细胞 2 次，根据油红 O 染色试剂盒说明书方法进
              按BYHWD处方称取各药材适量，加入10倍量水煎                       行染色（阳性染色呈红色样脂滴）。采用显微镜观察各
          煮1.5 h，收集滤液；继续向药渣中加入8倍量水煎煮1 h，                     组细胞形态并拍照。利用Image J软件对细胞中脂滴面
          合并 2 次滤液，最后浓缩成质量浓度为 1.43 g/mL（以生                   积进行定量分析，并计算脂滴面积占比（脂滴面积占
          药量计）的BYHWD药液，备用。取上述药液500 mL，加                      比＝脂滴面积/视野总面积×100%）。
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          入无水乙醇适量，采用水提醇沉法进行提取 。取醇沉                           2.6 细胞中TG及氧化应激、肝功能指标水平检测
          部位，经旋转蒸发除去残留溶剂后，冷冻干燥成粉末（即                              将 L02 细胞按“2.4”项下方法分组、造模与给药（接
          CC有效部位，得率为4.488%）；取上清液，通过减压蒸馏                      种于24孔板中），干预24 h后，收集细胞。根据试剂盒说
          法去除其中的乙醇，得乙醇部位浓缩液。将乙醇部位浓                           明书方法操作，检测细胞中 TG 及氧化应激（MDA、
          缩液用 AB-8 型大孔吸附树脂柱进行分离，具体分离条                        SOD）、肝功能（ALT、AST）指标水平。
          件如下：将乙醇部位浓缩液以3 mL/min的流速通过大孔                       2.7 细胞中AMPK、SREBP-1、GPAT mRNA表达检测
          吸附树脂柱，动态吸附 2 h，再分别用 30%、50%、75% 乙                      将 L02 细胞按“2.4”项下方法分组、造模与给药（接
          醇以3 mL/min的流速进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇                       种于6孔板中），干预24 h后，收集细胞。根据相应试剂
          洗脱液，经减压蒸馏法去除洗脱液中的乙醇后，冻干成                           盒说明书方法提取细胞中总 RNA，验证其浓度和纯度
          粉末（即 30YC、50YC、75YC 有效部位，得率分别为                     后，将其逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为模板，进行 PCR
          0.987%、0.603%、0.138%）。                             扩增。PCR扩增体系为：2×Universal Blue SYBR Green
          2.2 BYHWD及其有效部位含药血清的制备                             qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA
              将大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组（纯水）、                       模板1 μL，无酶水8.2 μL。扩增条件为：95 ℃预变性30 s；
          辛伐他汀组（阳性对照组，2 mg/kg，根据临床等效剂量换                      95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 次循环。以
          算）、BYHWD组[14 g/kg（以生药量计），根据临床等效剂                   GAPDH 为 内 参 ，采 用 2    －ΔΔCt  法 计 算 细 胞 中 AMPK、
          量换算]、CC 组（0.63 g/kg，以 BYHWD 的等效剂量 14               SREBP-1、GPAT mRNA 表达水平。PCR 引物由武汉塞
          g/kg 乘以该部位得率作为给药剂量，下同）、30YC 组                      维尔生物科技有限公司设计并合成，具体序列及扩增产
         （0.138 g/kg）、50YC组（0.084 g/kg）、75YC组（0.019 g/kg），   物长度见表1。
          每组 6 只。各组大鼠灌胃相应药液/纯水，每天早晚各 1                               表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          次，连续5 d。末次给药后次日，各组大鼠使用乌拉坦进                          基因                  引物序列             扩增产物长度/bp
          行麻醉，然后腹主动脉取血，将血样以 3 000 r/min 离心                    GAPDH      上游：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′  168
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          10 min，取上层血清以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得含药
                                                              AMPK       上游：5′-GAATCCGAAGTCAGAGCAAACC-3′  253
          血清/空白血清。将血清置于－80 ℃条件下保存，备用。                                    下游：5′-GAACGCTGAGGTGTTGAGGAA-3′
          2.3 细胞培养                                            SREBP-1    上游：5′-CACCGTTTCTTCGTGGATGG-3′  197
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              将 L02 细胞复苏后，将其接种在含有 10% 胎牛血                     GPAT       上游：5′-TCTTTGCGTGGGCTACCTT-3′  156
          清、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，然后置于                                 下游：5′-CCAGAGCCTTACTACTACCACTTCG-3′


          中国药房  2026年第37卷第3期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 3    · 301 ·
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