Page 20 - 《中国药房》2025年18期
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2.1.3 小鼠血清中炎症细胞因子水平检测 为5′-AGGTCCACGGGAAAGACACAGG-3′，产物大小
另取24只小鼠按“2.1.1”项下方法分组、建模、给药， 为 97 bp；NLRP3 的正向引物为 5′-CTCTGTTCACTGG-
每组8只，雌雄各半。术后28 h，各组小鼠眼底静脉丛采 CTGCGGATG-3′，反向引物为 5′-TGGTCCTTTCCTC-
血至无菌 EP 管中，5 000×g 离心 10 min，取上清液，按 ACGGTCTCC-3′，产物大小为243 bp；IL-18的正向引物
ELISA试剂盒要求操作，检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平。 为5′-CCGGATATCAACTTTGGCCGACTTCACT-3′，反
2.1.4 小鼠肺组织形态学观察 向 引 物 为 5′-CCGCTCGAGACTTTGATGTAAGTTAG-
“2.1.3”项下小鼠采血后处死，取肺组织，经水洗、脱 TGAGAGTG-3′，产物大小为 93 bp；caspase-1 的正向引
水、透明、浸蜡、包埋后切片（3 μm），进行常规HE染色， 物为5′-ATGGCCGACAAGGTCCTGAGG-3′，反向引物
中性树胶封片，显微镜下观察肺组织病理学变化，并 为5′-GACATGATCGCACAGGTCTCGTG-3′，产物大小
拍照。
为183 bp；β-actin的正向引物为5′-CGTAAAGACCTCT-
2.2 体外实验
ATGCCAACA-3′，反向引物为5′-TAGGAGCCAGGGC-
2.2.1 骨化三醇使用浓度的选择
AGTAATC-3′，产物大小为100 bp。
将RAW264.7细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后
2.2.5 细胞焦亡观察和Ca 水平检测
2+
更换无血清培养基，加入不同浓度（10、100 nmol/L和1、
按“2.2.2”项下方法建模、分组、给药处理细胞，收样
2、5、10、50 μmol/L）骨化三醇处理细胞，每个浓度设置5
前 30 min 分别加入 calcein-AM/PI 染料（观察细胞焦亡）
个复孔。另设培养基（Medium）组为对照。处理 24 h
或Fluo-AM荧光探针（检测Ca 水平）并放回细胞培养箱
2+
后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，使用酶标
中继续培养。30 min后使用共聚焦显微镜观察并拍照，
仪检测 450 nm 波长处吸光度（A）值，以 Medium 组细胞
同时采用Image J（V1.8.0.112）软件分析PI阳性率和Ca 2+
活性为 100%，计算其他各组细胞活性，细胞活性＝
荧光强度。
A 值实验组/A 值 Medium组×100%。选择不影响细胞活性的最
2.2.6 细胞中LDH漏出率和caspase-1活性检测
大浓度作为骨化三醇的使用浓度。
2.2.2 细胞建模、分组与给药 按“2.2.2”项下方法建模、分组、给药处理细胞，收样
将 RAW264.7 细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后 前 1 h 按 LDH 检测试剂盒或 caspase-1 活性检测试剂盒
更换无血清培养基，加入5 ng/mL LPS处理12 h，然后更 说明书操作后继续培养。1 h后使用酶标仪测定450 nm
换上清液，加入 100 ng/mL LPS 处理细胞 4 h，建立 LPS 波长处的 A 值。以 Medium 组的 LDH 和 caspase-1 活性
耐受细胞模型，作为 LPS 耐受组。除不加入 5 ng/mL 均为100%，计算LDH漏出率和caspase-1活性。LDH漏
LPS处理12 h外，其余方法同LPS耐受组操作，作为LPS 出率/caspase-1活性＝A值实验组/A值 Medium组×100%。
组。2 次均不加入，其余方法同 LPS 耐受组操作，作为 2.3 统计学方法
Medium组。在LPS耐受组基础上，随2次LPS同时加入 采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件对数据进行统计处
骨化三醇（根据“2.2.1”考察结果设置浓度）处理细胞，作 理及绘图。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方
为骨化三醇组。每组设置5个复孔。 差 分 析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 采 用
2.2.3 细胞中TNF-α和IL-6水平检测 Kaplan-Meier 法处理生存数据并绘制曲线，采用 Log-
收集“2.2.2”项下各组细胞上清液，按ELISA试剂盒 rank检验比较曲线间的差异。检验水准α＝0.05。
要求操作，检测其中TNF-α和IL-6水平。 3 结果
2.2.4 细胞中焦亡相关基因表达检测 3.1 体内实验结果
采用实时荧光定量 PCR 法检测。收集“2.2.2”项下 3.1.1 骨化三醇对模型小鼠7 d生存率的影响
各组细胞，裂解细胞提取总 RNA，反转录为 cDNA。按
假手术组、CLP 组和骨化三醇组小鼠 7 d 生存率分
SYBR Green定量预混液说明书配制反应体系：cDNA模
别为100.00%、68.75%、81.25%，生存曲线见图1。
板 1 μL，SYBR Green 4 μL，正、反向引物各 0.5 μL，
100 100.00% 假手术组
ddH2O 4 μL。反应条件为：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变 CLP组
80 81.25%
性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 39 个循环。 60 68.75% 骨化三醇组
以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算IL-1β、 生存率/% 40
NLRP3、IL-18 和 caspase-1 mRNA 的表达量，并以 Me‐ 20
dium 组为参照进行归一化处理。引物由北京擎科生物 0
3
4
科技股份有限公司设计合成。IL-1β 的正向引物为 0 1 2 术后时间/d 5 6 7
5′-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3′，反向引物 图1 各组小鼠的7 d生存曲线（n＝16）
· 2234 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 18 中国药房 2025年第36卷第18期
