Page 25 - 《中国药房》2025年18期
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第         公司；RPMI-1640培养基（批号6124579）购自美国Gibco
          六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，位列我国癌                           公司；兔抗细胞核增殖相关抗原Ki-67多克隆抗体、兔β-
          症相关死亡原因的第2位          [1―2] 。目前，手术切除仍是HCC           肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的
          治疗的首选方案，但由于该病起病隐匿，多数患者在确                           山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号分别为 GB111499、
          诊时已处于中晚期，丧失手术机会，故以化疗、靶向治疗                          GB11001、GB23303）均购自武汉赛维尔生物科技有限公
          及免疫治疗为核心的药物治疗策略已成为中晚期 HCC                          司；兔抗 Fas 单克隆抗体（批号 ab133619）购自英国 Ab‐
                            [3]
          患者的主要治疗手段 。然而，临床实践显示，这些药物                          cam公司；兔抗切割的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、
                                                       [4]
          的不良反应及耐药性等问题严重影响了患者的预后 。                           cleaved caspase-8、FasL 单克隆抗体（批号分别为 9664、
          因此，开发新型安全、有效的抗 HCC 药物具有重要                          9496、68405）均购自美国CST公司。
          意义。                                                1.3 细胞与实验动物
              中药及其活性成分因具有高效、低毒等特点，已成                             人肝癌 HepG2、SMMC-7721、Bel-7404 细胞株均由
                              [5]
          为抗癌药物的重要来源 。重楼皂苷Ⅸ（polyphyllin 9，                   空军军医大学西京医院肿瘤生物学国家重点实验室
          PP9；分子式 C45H72O17 ），是本课题组前期从宽叶重楼                   惠赠。
          Paris polyphylla var. latifolia 中分离出的主要活性成分            SPF级BALB/c雄性裸鼠，4周龄，体重（20±2）g，购
              [6]
          之一 。前期研究发现，PP9 能够诱导结直肠癌细胞凋                         自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号为
          亡并阻滞其细胞周期，显著抑制裸鼠移植瘤的生长，且                           SCXK（湘）2019-0004。所有动物均饲养于空军军医大
                                    [7]
          对主要脏器无明显的毒副作用 。此外，多项研究证实，                          学实验动物中心[温度（22±2）℃、相对湿度40%～70%、
                                       [10]
                               [9]
                     [8]
          PP9对宫颈癌 、尤因肉瘤 、胶质瘤 等多种肿瘤细胞均                        12 h光照/12 h黑暗循环]，自由摄食、饮水。本实验方案
          具有明显的抑制作用；同时，该成分亦能抑制人肝癌                            通过空军军医大学实验动物中心福利与伦理委员会审
                              [11]
          SMMC-7721细胞的增殖 ，但其能否诱导肝癌细胞凋亡                       查（编号IACUC-20191120）。
          及其具体机制尚不清楚。凋亡相关因子 Fas/Fas 配体                       2 方法
         （Fas ligand，FasL）信号通路能够介导细胞外源性凋亡，                   2.1 细胞实验
          在 HCC 等多种癌症的发生发展中具有重要作用 。研                         2.1.1 细胞培养
                                                   [12]
          究指出，结构与PP9相似的甾体皂苷及重楼总皂苷均能                              将 HepG2、SMMC-7721、Bel-7404 细 胞 接 种 于 含
          通过调控 Fas/FasL 信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡               [13―14] ，  10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基（简称“完全培养
          遂本课题组推测 PP9 诱导肿瘤细胞凋亡的作用可能与                         基”）中，在 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养（培养条件下
          上述信号通路有关。基于此，本研究从Fas/FasL信号通                       同），待细胞生长至对数生长期后进行后续实验。
          路出发，探讨 PP9 对 HCC 细胞凋亡的影响及潜在机制；                     2.1.2 细胞及药物干预条件筛选
          同时，通过构建荷瘤裸鼠模型，初步验证 PP9 的体内抗                            取对数生长期的 HepG2、SMMC-7721、Bel-7404 细
          HCC作用，以期为PP9的进一步开发及应用提供理论和                         胞，经胰酶消化后重悬于完全培养基中，调整密度至5×
          实验依据。                                              10 个/mL并以每孔100 μL接种于96孔培养板中。培养
                                                               4
          1 材料                                               24 h后，将细胞分为空白组（不加细胞与药物，只加培养
          1.1 主要仪器                                           基）、对照组（0.1%DMSO+培养基）、不同浓度PP9组（1、
                                           TM
              本研究所用主要仪器包括Cytomics  FC500型流式                  2、4、8、16、32 μmol/L，浓度依据前期预实验和相关文
                                                               [7]
          细胞仪（美国 Beckman Coulter 公司），3111 型 CO2培养            献 设置），每组设置5个复孔。分别继续培养24、48、72
          箱、Varioskan LUX 型酶标仪（美国 Thermo Fisher Scien‐       h。随后，向每孔加入CCK-8试剂10 μL，于37 ℃下避光
          tific公司），ChemiDoc型化学发光成像系统、iMark680型               孵育 2 h，使用酶标仪于 450 nm 波长处测定各孔的吸光
          酶标仪（美国 Bio-Rad 公司），Ⅸ71 型倒置显微镜（日本                   度（A）值并计算细胞存活率[细胞存活率＝（A 实验组－
          Olympus公司）等。                                       A 空白组）/（A 对照组 －A 空白组）×100%]，使 用 GraphPad  Prism
          1.2 主要药品及试剂                                        9.0 软件计算 PP9 对各细胞系的半数抑制浓度（IC50 ），再
                                                 [6]
              PP9（纯度≥98%）由本课题组提取、制备 ；5-氟尿                    根据上述结果，选择敏感的细胞系、最佳药物浓度和最
          嘧 啶（5-fluorouracil，5-Fu）对 照 品（阳 性 对 照 ，批 号         适干预时间，用于后续研究。
          22009，纯度≥98%）、Fas 抑制剂 KR-33493 的对照品（批              2.1.3 HepG2细胞克隆形成能力检测
          号24010，纯度99.94%）均购自美国MCE公司；胎牛血清                        取对数生长期的 HepG2 细胞，以 500 个/孔接种于 6
         （批号 CE011023）购自新西兰 NEWZERUM 公司；An‐                  孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组和不同浓度PP9
          nexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡试剂盒（批号 SB-F6012）、CCK-8           组（2、4 μmol/L），每组设置 3 个复孔。各组以（含药）培
          试剂盒（批号 C6901030）均购自上海翊圣生物科技有限                      养基培养 14 d（每 2 d 更换培养基 1 次）后，弃去培养基，


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2239 ·
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