Page 19 - 《中国药房》2025年18期
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which  promotes  the  release  of  Ca   from  the  endoplasmic  reticulum，  thereby  driving  the  NLRP3/caspase-1-mediated  pyroptosis
                                    2+
          pathway.
          KEYWORDS    calcitriol； sepsis； immunosuppression； pyroptosis； Ca 2+


              脓毒症是创/烧伤和感染患者的常见并发症，病死率                        号 ST210506）购自德国 PAN-Biotech GmbH 公司，肿瘤
          为 30%～70%，由二次感染导致的免疫抑制是脓毒症中                        坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介
          晚期患者死亡的主要原因           [1―2] 。研究发现，严重缺乏维            素 6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶 联 免 疫 吸 附 测 定
                                                [3]
          生素D（vitamin D，VD）会增加脓毒症的易感性 。本课题                  （ELISA）试剂盒（批号分别为 326012-009、330384-011、
          组前期研究亦发现，维生素 D 受体（vitamin D receptor，              303156-011）均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司，
          VDR）在脓毒症免疫抑制中发挥重要作用                 [4―5] 。骨化三     CCK-8 试剂盒（批号 22346564）购自北京兰杰柯科技有
          醇作为 VD 的活性代谢产物，通过与 VDR 结合发挥作                       限公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测
          用，不仅能维持机体钙磷代谢平衡，更关键的是可发挥                           试剂盒、钙黄绿素（calcein-AM）/碘化丙啶（propidium
                              [6]
                                                    2+
          调节免疫与炎症的作用 。内质网释放的大量Ca 内流                          iodide，PI）活/死细胞双染试剂盒、caspase-1 活性检测试
          是驱动细胞焦亡和免疫反应的重要内源性信号，会激活                           剂盒、Ca 荧光探针Fluo-AM（批号分别为081823231211、
                                                                     2+
          核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结                            080223231212、013123231211、073023231225）均购自上
          构域受体3（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat   海碧云天生物技术有限公司，RNA 快速提取盒（批号
          and pyrin domain-containing receptor 3，NLRP3）和胱天
                                                             20231121）购自苏州新赛美生物科技有限公司，RNA 逆
          蛋白酶1（caspase-1），分泌促炎性细胞因子，最终导致细
                                                             转录试剂盒（批号962433L13W01）购自武汉爱博泰克生
                [7]
          胞焦亡 。细胞焦亡参与机体抵御病原体侵袭的过程，
                                                             物 科 技 有 限 公 司 ，SYBR  Green 定 量 预 混 液（批 号
          使病原体抗原暴露于适应性免疫系统并释放炎症因子，
                                                             64506228）购 自 美 国 Bio-Rad 公 司 ，蓖 麻 油（批 号
          促进炎症反应和组织修复，而免疫抑制状态的形成也与
                                                             20230503）购自河北武邑炎威医疗科技有限公司。
          细胞焦亡受到抑制密切相关 。
                                  [7]
                                                             1.3 实验动物与细胞
              VD/VDR 信号系统广泛分布于单核-巨噬细胞等免
                                                                 BALB/c 小鼠（SPF 级），雌雄各半，体重 18.0～22.0
                                                 [6]
          疫细胞中，表现出显著的免疫调节和抗炎特性 。因此，
                                                             g，4～6 周龄，购自广东南模生物科技有限公司，生产许
          本研究采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，
                                                             可 证 号 为 SCXK（粤）2022-0062。 小 鼠 在 温 度（25±
                                         [8]
          CLP）建立脓毒症免疫抑制小鼠模型 ，同时，选用小鼠
                                                             1）℃，相对湿度 50%±5%，每 12 h 明暗交替循环的动物
          巨噬细胞系 RAW264.7 建立脂多糖（lipopolysaccharide，
                                                             房中饲养，自由摄食、饮水。动物实验通过中部战区总
          LPS）耐受细胞模型（即脓毒症免疫抑制细胞模型），在体
                                                             医院实验动物伦理委员会批准，编号：中总动（福）第
          内外探究骨化三醇逆转免疫抑制的作用及潜在机制，为
                                                             20221027号。
          脓毒症免疫抑制治疗提供参考。
          1 材料                                                   小鼠巨噬细胞系RAW264.7购于中国医学科学院基
                                                             础研究所（国家生物医学实验细胞资源库）。
          1.1 主要仪器
                                                             2 方法
              本研究所用主要仪器有Model 550型酶联分析仪和
                                                             2.1 体内实验
          CFX Connect 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美
                                                             2.1.1 小鼠分组、建模与给药
          国Bio-Rad公司）、SCIENTZ-96型高通量组织匀浆器（宁
          波新芝生物科技股份有限公司）、VMR型小动物呼吸麻                              体内模型采用本课题组已建立的 CLP 诱导脓毒症
                                                                              [8]
          醉机（美国Matrx公司）、NanoDrop型微量核酸蛋白浓度                    免疫抑制小鼠模型 。取小鼠随机分为假手术组、CLP
          测定仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、CKX53 型        组和骨化三醇组，每组 16 只，雌雄各半。CLP 组和骨化
          荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）、Zeiss LSM780型                 三醇组小鼠经麻醉后，开腹分离盲肠并结扎 1.0 cm，使
          共聚焦显微镜（德国Analytik Jena AG公司）。                      用 16 号钢针穿孔后缝合腹腔，建立脓毒症免疫抑制模
          1.2 主要药品与试剂                                        型。此时间点记为术后 0 h。假手术组小鼠除不结扎
              骨化三醇（纯度≥98%，批号2219294）、改良苏木精-                  外，其余操作同 CLP 组。骨化三醇组小鼠于术后 0、24、
                                                                                        [9]
          伊红（HE）染色试剂盒（批号 G1121）均购自北京索莱宝                      48、72 h灌胃骨化三醇（1 μg/kg） ，假手术组和CLP组小
          科技有限公司，LPS（纯度≥98%，批号046M4045V）购自                   鼠同时灌胃等体积蓖麻油，每10 g（体重）给予0.1 mL。
          美国 Sigma 公司，动物用异氟烷（批号 217150301）购自                 2.1.2 小鼠7 d生存率分析
          深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，DMEM细胞培养                              观察“2.1.1”项下各组小鼠术后 7 d 内的生存情况，
          基（批号 6124614）购自美国 Hyclone 公司，胎牛血清（批                计算7 d生存率。


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2233 ·
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