Page 31 - 《中国药房》2025年16期
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级动物房（温度22～24 ℃、相对湿度60%～70%、每12 h                   释度均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相
          光照/黑暗交替）内。本研究方案已通过该院实验动物伦                          应二抗（稀释度为 1∶10 000），于室温下孵育 1.5 h；再次
          理委员会审查批准（批准编号AEWC-2024350）。                        洗膜后，以 ECL 发光液显色，并于化学发光成像系统下
          2 方法                                               成像。使用Image J软件分析目的蛋白与内参蛋白的条
          2.1 造模、分组与给药                                       带灰度值比值，用以表示目的蛋白的相对表达量。
              所有小鼠适应性喂养 1 周后，选择血糖水平＞11.1                     2.7 潜在作用靶点挖掘与验证
                [8]
          mmol/L 的 db/db 小鼠（即 T2DM 模型小鼠）32 只，按体              2.7.1 基于非靶向脂质组学的潜在靶点挖掘
          重分为模型组，小檗碱低、高剂量组[100、200 mg/（kg·d），                   （1）样本处理：取“2.2”项下正常对照组、模型组、小
          以 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液为溶剂，剂量参考相关文                        檗碱高剂量组小鼠血清样品各20 μL，加甲醇225 μL，涡
            [9]
          献 和预实验结果设置]和二甲双胍组[300 mg/（kg·d），                   旋混匀5 s，加入甲基叔丁基醚750 μL，于室温下静置30
                          [10]
          剂量参考临床剂量 和预实验结果设置]，每组 8 只；取                        min；加水188 μL，涡旋混匀20 s，于室温下静置10 min，
          wt/wt小鼠8只，作为正常对照组。各药物组小鼠灌胃相                        于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min；取上清液 700 μL，
          应药液，正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积水，每天1                          以氮气流吹干，残渣加入复溶液（异丙醇-乙腈-水，30∶65∶
          次，持续6周。实验期间，各组小鼠均正常摄食、饮水。                          5，V/V/V）100 μL，涡旋混匀 30 s，再于 4 ℃下以 12 000
          2.2 体重、体型观察及取材                                     r/min 离心 10 min，取上清液，备测。取上述各组样本上
              实验期间，每周测定各组小鼠体重并分析其末周体                         清液5 μL，混匀，作为质控（quality control，QC）样品，用
          重差异。末次给药并禁食、不禁水6 h后，于各组小鼠尾                         于检验系统的稳定性。
          尖取血，采用血糖仪检测其空腹血糖（fasting blood glu‐                   （2）色谱与质谱条件：取上述待测样品和QC样品各
          cose，FBG）水平。随后，以异氟烷吸入麻醉各组小鼠，摘                      适量，采用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用（LC-Q-
          眼球取血并以颈椎脱臼法处死，观察其体型并拍照；所                           TOF-MS）技术进行检测。以 Phenomenex Kinetex C18
          取血样于常温下静置1 h后，以3 500 r/min离心10 min，               （2.1 mm×100 mm，2.6 μm）为色谱柱，以水-乙腈-甲醇
          分离上层血清，于－80 ℃下保存，备测。剖取大鼠肝脏，                       （3∶1∶1，V/V/V；含 5 mmol/L 乙酸铵）为流动相 A、异丙醇
          观察外观并拍照；称重后，取部分用4%多聚甲醛溶液固                         （含5 mmol/L乙酸铵）为流动相B进行梯度洗脱（0～0.5
          定，其余部分于－80 ℃下保存，备测。                                min，20%B；0.5～2  min，20%B→40%B；2～4  min，
          2.3 血脂及肝功能指标检测                                     40%B→60%B；4～12.5  min，60%B→98%B；12.5～14
              取“2.2”项下各组小鼠血清样品适量，按照相应试剂                      min，98%B；14～14.1 min，98%B→20%B；14.1～17 min，
          盒说明书操作，使用酶标仪于特定波长下检测其血清中                           20%B）；流速为 0.3 mL/min；柱温为 40 ℃；进样量为 1
          TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量和 ALT、AST 水平。同时，               μL。采用电喷雾离子源，于正、负离子模式下进行飞行
          按下式计算肝脏指数：肝脏指数＝肝脏质量/小鼠体重×                          时间质谱一、二级扫描，扫描范围分别为m/z 10～1 500、
          100%。                                              m/z 200～1 500；离子源温度为 500 ℃；离子源电压分别
          2.4 FINS检测及相关参数计算                                  为5 500 V（正离子）、－4 500 V（负离子）；去簇电压分别
              取“2.2”项下各组小鼠血清样品适量，按照相应                        为 80 V（正离子）、－80 V（负离子）；碰撞电压分别为
          ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测其血清FINS                      （40±20）V（正离子）、－（40±20）V（负离子）。
          水平，并按下式计算胰岛素抵抗指数（HOME-IR）、胰岛                          （3）数据处理：收集样品的色谱、质谱信息，采用
          素敏感性指数（ISI）：HOMA-IR＝（FINS×FBG）/22.5；               SCIEX OS软件进行峰校准、峰提取和归一化处理，并基
                            [11]
          ISI＝1/（FINS×FBG） 。                                 于所获样品离子信息、保留时间等构建多变量数据矩
          2.5 肝组织病理学观察                                       阵。以归一化后的峰面积为变量，采用 SCIEX OS 软件
              取“2.2”项下各组小鼠经 4% 多聚甲醛溶液固定的                     进行无监督的主成分分析（principal component analysis，
          肝组织适量，以甲苯、乙醇梯度脱水后，行常规石蜡包                           PCA）、偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-
          埋、切片（厚度约4 μm）；取切片，经苏木精-伊红（HE）染                     discriminant analysis，PLS-DA）及 100 次置换检验，以评
          色后，使用显微镜观察其肝组织病理学改变并拍照。                            估模型的可靠性。对检测到的所有代谢物进行差异分
          2.6 肝组织中脂肪酸合成相关蛋白表达检测                              析，并计算其变量重要性投影（variable importance in
              采用Western blot法检测。取“2.2”项下各组小鼠冻                projection，VIP），以VIP＞1、组间差异倍数（fold change，
          存的肝组织适量，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和                         FC）＞1.50 或＜0.67、方差分析所得 P＜0.05 为标准，筛
          磷酸酶抑制剂），匀浆，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15              选潜在差异代谢物 ；根据质谱信息，利用 HMDB 数据
                                                                              [12]
          min，取上清液；上清液经 BCA 法测定蛋白浓度后，于                       库（http：//hmdb.ca/），初步确定潜在差异代谢物的结构；
          100 ℃下加热 10 min 变性。取变性蛋白适量，进行                      利用 MetaboAnalyst 6.0 在线平台（http：//www.metabo‐
          10%SDS-PAGE 分离，再转至 PVDF 膜上，以 5% 脱脂牛                analyst.ca/）进行代谢通路富集分析，以通路影响（path‐
          奶 封 闭 1.5  h；洗 膜 后 ，加 入 脂 肪 酸 合 成 相 关 蛋 白          way impact）值＞0.10（该阈值通过路径拓扑分析计算而
                                                                                       [13]
         （SREBP1、FASN、ACC1）和内参蛋白（β-actin）一抗（稀                得）为标准，筛选潜在代谢途径 。

          中国药房  2025年第36卷第16期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16    · 1977 ·
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