Page 81 - 《中国药房》2025年7期
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2 方法                                               2.7 肝组织脂质沉积观察
          2.1 造模                                                 取“2.6”项下各组 6 只大鼠剩余肝组织适量，经包
              大鼠适应性喂养7 d后，分为造模组（n＝63）和对照                     埋、切片（4 µm）、油红 O 染色、60% 异丙醇冲洗后，以苏
          组（Control 组，n＝15）。造模组大鼠参考文献方法建立                    木精复染，封片后，采用倒置荧光显微镜观察大鼠肝组
                    [10]
          NASH 模型 ：大鼠以高糖高脂饮食[含 20% 蛋白质、                      织脂质沉积情况，并采用Image-pro Plus 6.0软件分析油
          35% 碳水化合物（包括 18% 蔗糖、10% 麦芽糖糊精、7%                   红O阳性染色面积占比。
          淀粉）、45%脂质]饲喂，Control组大鼠以基础日粮饲喂，                    2.8 肝组织纤维化观察
          6 周后，随机挑选 3 只造模组大鼠与 3 只 Control 组大鼠                    取“2.6”项下剩余肝组织切片，置于 60 ℃条件下烤
          进行指标检测。若造模组大鼠相关指标（肝指数、组织                           片过夜，再以二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；经 Masson 染
          病理变化、血清炎症因子水平）显著异于Control组，则视                      料依次染色后，以中性树胶封片，采用光学显微镜观察
          为造模成功。                                             大鼠肝组织纤维化情况，并采用Image-pro Plus 6.0软件
          2.2 分组与给药                                          计算胶原沉积分数（胶原沉积分数＝视野下胶原纤维化
              将造模成功的剩余大鼠随机分为模型组（Model                        面积/总面积×100%）。
          组）、Met 低剂量组（Met-L 组）、Met 中剂量组（Met-M                2.9 肝组织中 PI3K/AKT/PDGF 信号通路相关蛋白和
          组）、Met高剂量组（Met-H组）、高剂量Met+PI3K激活剂                  Caspase-3蛋白表达检测
          组（Met-H+740 Y-P 组），每组 12 只。Met-L 组、Met-M               取各组另外 6 只大鼠的肝组织适量，加入预冷的蛋
                                                      [11]
          组、Met-H组大鼠分别灌胃100、200、400 mg/kg的Met ，              白裂解液充分反应，离心取上清液，并采用BCA法对总
          每天1次，连续6周。Met-H+740 Y-P组大鼠在每次灌胃                    蛋白进行定量。蛋白经变性处理后，采用十二烷基硫酸
                                                      [12]
          400 mg/kg Met 后，尾静脉注射 50 mg/kg 的 740 Y-P 。         钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白并将其转移到
                                                             PVDF膜上；以5%脱脂奶粉封闭后，加入p-PI3K、PI3K、
          Control 组和 Model 组大鼠除灌胃等体积的生理盐水替
                                                             p-AKT、AKT、PDGF、Caspase-3、β-actin 一抗（稀释比例
          代Met外，其他处理方式同药物干预组。
                                                             均为1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜；以TBST洗膜后，加入
          2.3 体重及肝指数检测
                                                             二抗（稀释比例为 1∶1 000）室温孵育 1 h。经 ECL 显影
              末次给药后对所有大鼠禁食不禁水12 h，称重后腹
                                                             后，进行凝胶成像，以目的蛋白与内参 β-actin 的灰度值
          腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠并进行腹主动脉
                                                             比值表示蛋白的表达水平，以p-PI3K与PI3K、p-AKT与
          采血，血样保存备用；处死大鼠后，取肝脏并称重，计算
                                                             AKT 蛋白的表达水平比值表示 PI3K、AKT 蛋白的磷酸
          肝指数（肝指数＝肝脏质量/体重×100%）；肝脏称重结
                                                             化水平。
          束后，保存备用。
                                                             2.10 统计学方法
          2.4 血清中炎症因子及生化指标水平检测
                                                                 采用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料（均符
              取“2.3”项下血样以3 000 r/min离心15 min，取上层
                                                             合正态分布）以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差
          血清备用；一部分血清用于检测炎症因子（IL-6、TNF-α）
                                                             分析，进一步组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准
          水平，一部分血清用于检测脂代谢（TC、TG、LDL-C）和
                                                             α＝0.05。
          肝功能（AST、ALT）指标水平，具体方法按试剂盒说明书
                                                             3 结果
          操作。
                                                             3.1 大鼠体重和肝指数检测结果
          2.5 肝组织中炎症因子水平检测
                                                                 如表1所示，相较于Control组，Model组大鼠体重和
              取“2.3”项下肝组织适量，加入预冷的生理盐水进行
                                                             肝指数均显著升高（P＜0.05）；相较于 Model 组，Met-L
          匀浆，按照试剂盒说明书方法检测大鼠肝组织中炎症因
                                                             组、Met-M 组、Met-H 组大鼠体重和肝指数均显著降低，
          子（IL-6、TNF-α）水平。
                                                             且呈剂量依赖性（P＜0.05）；相较于 Met-H 组，Met-H+
          2.6 肝组织病理变化观察
                                                             740 Y-P组大鼠体重和肝指数均显著升高（P＜0.05）。
              各组随机取 6 只大鼠的部分肝组织（剩余部分用于
                                                                 表1 各组大鼠体重、肝指数比较（x±s，n＝12）
          脂质沉积检测），置于 10% 甲醛溶液中固定 24 h；经脱
                                                              组别       体重/g  肝指数/%  组别         体重/g    肝指数/%
          水、包埋、切片（5 µm）后，取部分切片（剩余切片用于纤                        Control组  457.41±16.72  2.57±0.20  Met-M组  543.11±10.53 bc  3.10±0.22 bc
          维化检测）进行 HE 染色，封片后，采用光学显微镜观察                         Model组  594.60±15.43 a  4.02±0.24 a  Met-H组  502.46±12.18 bcd  2.83±0.19 bcd
                                                              Met-L组  572.30±11.09 b  3.58±0.20 b  Met-H+740 Y-P组  581.02±13.12 e  3.88±0.26 e
          大鼠肝组织病理变化并进行非酒精性脂肪性肝病活动
                                                                a：与Control组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与
          度 评 分（non-alcoholic  fatty  liver  disease  activity  score，
                                                             Met-L组比较，P＜0.05；d：与Met-M组比较，P＜0.05；e：与Met-H组比
               [13]
          NAS） 。                                             较，P＜0.05。
          中国药房  2025年第36卷第7期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 7    · 839 ·
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