Page 33 - 《中国药房》2024年6期
P. 33

干燥，得 HDP。应用苯酚-浓硫酸法测定 HDP 的质量                       培养基，HDP低、高浓度组细胞分别给予含4 mmol/L异
              [12]
          分数 。                                               烟肼和相应浓度HDP（2、4 mg/mL）的培养基，培养24 h，
          2.2 基于斑马鱼模型评价HDP对异烟肼致肝损伤的保                         采用CCK-8法检测细胞存活率。同法处理细胞后，收集
          护作用                                                细胞按AO/PI试剂盒说明书方法进行双重染色，使用酶
          2.2.1 HDP干预浓度的筛选                                   标仪观察细胞存活情况。
              斑马鱼胚胎发育 3 d 后，选择正常发育的斑马鱼幼                      2.3.3 HDP对L02细胞上清液中ALT、AST水平及细胞
          鱼，以每孔 30 尾置于 6 孔板中，随机分为正常组、模型                      裂解液中GSH含量的影响
                                                                                  6
          组、HDP 组，每组设 3 个复孔。正常组斑马鱼给予胚胎                           将L02细胞以1×10  个/孔的密度接种于6孔板中，
          培养液，模型组斑马鱼给予含4 mmol/L异烟肼的胚胎培                       培养 24 h 后，按“2.3.2”项下方法分组、处理，每组设 3 个
              [13]
          养液 ，HDP组斑马鱼给予含4 mmol/L异烟肼和不同浓                      复孔，收集细胞上清液和细胞裂解液，按试剂盒说明书
          度 HDP（800、600、400、200、150、100、50 μg/mL，加胚胎         方法分别检测细胞上清液中AST、ALT水平及细胞裂解
          培养液超声处理使溶解）的胚胎培养液。将所有平板置                           液中GSH含量。
          于 28 ℃恒温培养箱中孵化，浸浴给药 72 h，每 24 h 换 1                2.3.4 HDP 对 L02 细胞中 Sirt1/Nrf2 信号通路相关蛋白
          次药液。以心脏骤停作为斑马鱼死亡的标准，通过一般                           表达的影响
          形态特征来确定畸变评分。以斑马鱼幼鱼的存活率和                                采用 Western blot 法检测。将“2.3.3”项下各组细胞
          畸变率为指标，筛选HDP的干预浓度。                                 裂解液与上样缓冲液混合，煮沸变性，电泳分离，转膜，
          2.2.2 斑马鱼肝脏荧光面积及荧光强度的测定                            用 5% 脱脂牛奶封闭后，在 4 ℃下分别加入 Sirt1、Nrf2、
              浸浴给药 72 h 后，随机选取“2.2.1”项下正常组、模                 HO-1、NQO1、GAPDH 抗体（稀释比例分别为 1∶1 000、
          型组和 HDP 低、高浓度组（50、100 μg/mL，根据“2.2.1”              1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），孵育过夜，洗涤3次
          项下实验结果选择）斑马鱼幼鱼8尾，在荧光显微镜下观                          后，加入二抗（稀释比例为 1∶5 000），室温孵育 1 h，用
          察斑马鱼的局部肝脏形态，使用 Image J 软件分析肝脏                      ECL试剂进行显影，并用多功能成像系统进行扫描。采
          荧光面积和荧光强度。                                         用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带
          2.2.3 斑马鱼肝组织病理学观察                                  灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值评价目
              浸浴给药 72 h 后，随机选取“2.2.1”项下正常组、模                 的蛋白的表达水平。
          型组和 HDP 低、高浓度组（50、100 μg/mL，根据“2.2.1”              2.4 统计学处理
          项下实验结果选择）斑马鱼幼鱼3尾，用4%多聚甲醛和                              采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行分析。实验数据
          2.5%戊二醛固定。取4%多聚甲醛固定的幼鱼，用分级                         以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
          乙醇脱水，加入二甲苯，石蜡包埋，切片，进行 HE 染色，                       两两组间比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          使用显微镜观察组织切片并拍照。取2.5%戊二醛固定                          3 结果
          的斑马鱼幼鱼，再用 1% 锇酸固定，用分级丙酮脱水，置                        3.1 HDP的提取得率与质量分数
          包埋液中，固化，超薄切片，用醋酸铀、柠檬酸铅染色，使                             1 000 g白花蛇舌草饮片，可提取获得12.35 g HDP，
          用透射电子显微镜观察组织切片并拍照。                                 得率为1.24%；HDP的质量分数为61.47%。
          2.3 基于L02细胞模型研究HDP对异烟肼致肝损伤的                        3.2 HDP对异烟肼致斑马鱼肝损伤的保护作用
          保护作用及机制                                            3.2.1 HDP对斑马鱼存活率和畸变率的影响
          2.3.1 异烟肼和HDP干预浓度的筛选                                   HDP质量浓度在150 μg/mL及以上时，斑马鱼的存
              将L02细胞按1×10 个/孔的密度接种于96孔板中，                    活率均低于95%，畸变率均高于15%，结果见表1。综合
                              4
          培养24 h后，分别加入浓度为2、4、6、8、16、32 mmol/L的               考虑，选择 100、50 μg/mL 作为后续斑马鱼实验 HDP 的
          异烟肼培养24 h，每个浓度设4个复孔，采用CCK-8法检                      高、低浓度。
          测细胞存活率，具体操作按试剂盒说明书方法进行。以                           表1 不同浓度 HDP 对斑马鱼存活率和畸变率的影响
          同样方法检测质量浓度分别为 1、2、4、8、16、24 mg/mL                       （x±s，n＝3）
          的HDP处理后的细胞存活率。细胞存活率＝（给药组平                           组别         药物浓度           存活率/%       畸变率/%
          均光密度值－校准平均光密度值）/（细胞空白对照组平                           正常组                        100           0
                                                              模型组   4 mmol/L异烟肼        98.89±1.92   7.85±1.86
          均光密度值－校准平均光密度值）×100%。
                                                              HDP组  4 mmol/L异烟肼+800 μg/mL HDP  0
          2.3.2 HDP对异烟肼致损伤L02细胞存活的影响                                4 mmol/L异烟肼+600 μg/mL HDP  21.51±3.85  100
              按照“2.3.1”项下方法接种、培养细胞 24 h，然后分                         4 mmol/L异烟肼+400 μg/mL HDP  35.56±1.92  56.56±3.15
                                                                    4 mmol/L异烟肼+200 μg/mL HDP  76.87±3.33  34.70±2.84
          为正常组、模型组和HDP低、高浓度组（2、4 mg/mL），每
                                                                    4 mmol/L异烟肼+150 μg/mL HDP  94.84±3.84  18.82±1.74
          组设 4 个复孔。正常组细胞给予含 10% 胎牛血清的                               4 mmol/L异烟肼+100 μg/mL HDP  100  10.00±3.33
          DMEM 培养基，模型组细胞给予含 4 mmol/L 异烟肼的                           4 mmol/L异烟肼+50 μg/mL HDP  100   7.78±1.92


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 667 ·
   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38