Page 32 - 《中国药房》2024年6期

肝损伤是各种肝脏疾病的病理基础，长期肝损伤可 （法国Vilber公司），CMax Plus型酶标仪（上海美谷分子
导致肝纤维化、肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭。药物性 仪器有限公司），CO2恒温细胞培养箱（上海精宏实验设
肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是由化学药物、 备有限公司）。
生物合成药物、天然药物等及其代谢产物引起的肝脏损 1.2 主要药品与试剂
害，发病率逐年上升，已成为全球肝病死亡的第五大诱 异烟肼对照品（批号 MKBQ8553V，纯度≥99%）购
因 [1―2] 。在我国，引起 DILI 的药物种类包括非甾体抗炎 自德国 Fluka 公司；白花蛇舌草饮片（批号 220602，产地
药、抗结核药、抗肿瘤药等，其中抗结核药导致的肝损伤 河南确山）购自安徽亿源药业股份有限公司；丙氨酸转
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发生率高达21.99% 。异烟肼是WHO推荐的标准抗结 氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（as‐
核治疗方案中的首选药物，但其在抗结核药中引起的肝 partate transaminase，AST）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）
损伤最多，发生率约为 48% 。儿童是结核病的高发人 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和 BCA 蛋白测定试
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群，异烟肼预防性治疗可使儿童结核潜伏感染发展为活 剂 盒（批 号 分 别 为 20220412、20211215、20220354、
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动性结核病的风险降低 50% 及以上 ，但由于儿童肝脏 20211224）均购自南京建成生物工程研究所；苏木精-伊
功能发育不成熟等因素，儿童异烟肼用药诱导产生的肝 红（HE）染色试剂盒（批号20211218）购自北京索莱宝科
损伤已成为不容忽视的问题。目前，西医治疗异烟肼致 技有限公司；DMEM 高葡萄糖培养基（批号 70090200）
肝损伤大都存在毒副作用大、疗效不理想等问题，而中 购 自 北 京 兰 杰 柯 科 技 有 限 公 司 ；胎 牛 血 清（批 号
医药治疗肝损伤具有多层次、多靶点、多途径综合调控 22020702）购自美国 Gibco 公司；CCK-8 检测试剂盒（批
的特点，在改善患者症状、降低肝损伤风险、延缓病情进 号G2026-1000T）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；吖
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展、增强机体修复能力等方面优势明显 。 啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双染试剂盒（批号VD144718）购
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氧化应激与 DILI 的发生发展密切相关 ，沉默信息 自北京百奥莱博科技有限公司；兔 Sirt1 单克隆抗体、兔
调节因子 1（silent information regulator 1，Sirt1）/核转录 Nrf2多克隆抗体、兔HO-1单克隆抗体、兔NQO1单克隆
因子红系 2 相关因子 2（nuclear factor-erythroid 2-related 抗体、兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos‐
factor 2，Nrf2）信号通路是机体重要的抗氧化应激通路， phate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体和辣根过氧
Sirt1激活能促进Nrf2核易位，从而上调血红素加氧酶1 化 物 酶 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（批 号 分 别 为
（heme oxygenase-1，HO-1）、醌 氧 化 还 原 酶 1（quinone ab189494、 ab137550、 ab189491、 ab80588、 ab9485、
oxidoreductase 1，NQO1）等抗氧化因子的转录与表达， ab150077）均购自英国Abcam公司；甲醇、乙醇等其他试
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发挥对 DILI 的改善作用 。白花蛇舌草为茜草科植物 剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。
白花蛇舌草 Hedyotis diffusa Willd. 的干燥全草，具有清 1.3 实验动物与细胞
热解毒、消肿散结之效 。白花蛇舌草多糖（polysaccha‐ 具有肝脏特异性荧光的转基因斑马鱼（L-FABP：
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rides from H. diffusa，HDP）作为其主要成分和重要活性 EGFP）由齐鲁工业大学生物研究所提供。斑马鱼的养
物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等多种药理 殖繁育参照The Zebrafish Book，操作遵循经济合作与发
作用，尤其是显著的抗氧化作用为其在氧化损伤类疾病 展组织标准。斑马鱼养殖条件如下：水温（28±0.5）℃，
治疗中的应用提供了有力支撑 。本研究基于结核病 pH 7.0～7.2，电导率 450～550 μs/cm，黑暗/光照周期为
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儿童发病特点及异烟肼用药肝损伤风险，选择生理、发 10 h/14 h，成年斑马鱼每日喂食丰年虾幼虫 3 次。斑马
育和代谢与人类高度相似的斑马鱼幼鱼为模型，研究 鱼胚胎置于斑马鱼胚胎培养液（5 mmol/L NaCl、0.17
HDP对异烟肼致肝损伤的影响，同时结合人肝L02细胞 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4 ）中，
模型，初步探讨其改善作用机制，旨在为 DILI 的治疗提 （28.0±0.5）℃下控光培养，每24 h更换胚胎培养液并及
供参考。 时去除死胚，胚胎密度控制在5枚/mL。
1 材料 人肝L02细胞（货号SNL-141）购自武汉尚恩生物技
1.1 主要仪器 术有限公司。
本研究所用主要仪器包括 1260 型高效液相色谱仪 2 方法
（美国 Agilent 公司），EP214C 型万分之一电子天平、 2.1 HDP的制备及含量测定
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AB135-S型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）， HDP的制备参考文献方法 ：取1 000 g白花蛇舌草
EG1150 型石蜡包埋机、RM2235 型石蜡切片机（德国 饮片粉碎，以 15 倍量的 80% 乙醇回流脱脂；收集药渣，
Leica 公司），KQ-250 型超声波清洗器（昆山市超声仪器 挥干溶剂后，加10倍量水提取2次，每次2 h；合并滤液，
有限公司），H1650-W型台式高速离心机（湖南湘仪实验 减压浓缩至相对密度约 1.015（60 ℃），滤过；滤液过
室仪器开发有限公司），SZX16 型荧光显微镜、FSX100 D101型大孔吸附树脂柱，收集药液，减压浓缩至一定体
型显微镜（日本 Olympus 公司），HT7800 型透射电子显 积，采用 Savage 法去除蛋白；上清液加入乙醇使醇含量
微镜（日本Hitachi公司），Fusion FX7型多功能成像系统 达90%，静置过夜，滤过，沉淀用乙醇洗涤，于60 ℃减压

· 666 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 6 中国药房 2024年第35卷第6期