Page 27 - 《中国药房》2024年6期
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小鼠灌胃 GA 混悬液（以 0.5%CMC-Na 溶液为溶剂）100                 2.2.3 代谢轮廓分析
          mg/kg，每天 1 次+尾静脉注射 DOX 药液 3 mg/kg，隔天 1                 取 CON 组、DOX 组、GDOX 组小鼠的心脏组织样
          次，连续 15 d。给药期间，隔天监测各组小鼠的体重变                        品，按“2.2.1”项下方法提取、处理后，再按“2.2.2”项下条
          化，观察其精神状态和饮食量，并绘制体重变化曲线。                           件进样检测，记录色谱和质谱信息。利用 Compound
          末次给药后2 h，各组小鼠摘眼球取血，于室温下静置30                        Discover 3.2 软件对 3 组小鼠心脏组织样品的原始数据
          min后，于4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，收集上层血               进行色谱峰提取、定位和峰面积归一化处理等，获取各代
          清，于－80 ℃保存。随机选取各组 6 只小鼠的血清样                        谢物的分子量、保留时间（retention time，RT）和峰面积等
          品，按照相应试剂盒说明书方法操作，使用多功能酶标                           信息。以各代谢物的峰面积（需进行降维处理）为变量，
          仪检测其中 AST、CK、CK-MB、LDH 水平，再次验证模                    采用SIMCA 13.0软件进行主成分分析（principal compo‐
          型是否复制成功并评价GA的干预效果。                                 nent analysis，PCA），以直观展示各组样品的差异性。
          2.2 代谢组学分析                                         2.2.4 DEMs筛选
          2.2.1 心脏组织代谢物提取及样品处理                                   为进一步分析组间差异并实现样品的有效分离，以
                                                             各代谢物的峰面积（需进行降维处理）为变量，采用
             （1）心脏组织样品采集：取血后，各组小鼠脱颈椎处
                                                             SIMCA 13.0 软件进行正交偏最小二乘-判别分析（or‐
          死，立即取下心脏，用提前预冷的生理盐水冲洗干净，再
                                                             thogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-
          以液氮速冻后，转移至－80 ℃冰箱中保存，备用。
                                                             DA），以变量重要性投影（variable importance in the pro‐
             （2）极性成分提取：临用前，将心脏组织于4 ℃下解
                                                             jection，VIP）值≥1、峰面积差异倍数（fold change，FC）＞
          冻，冰上剪碎后，称取样品 50 mg 置于 2 mL EP 管中，加
                                                                              [8]
                                                             1且P＜0.05为标准 筛选DEMs。
          入预冷的 50% 甲醇 1.5 mL，于冰浴中匀浆，制备组织匀
                                                             2.2.5 生物学分析
          浆液。取该组织匀浆液，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心
                                                                 借助 HMDB 数据库（http：//www.hmdb.ca/metabo‐
          15 min，取上清液，以氮气流吹干，即得极性成分，于
                                                             lites）、PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.
          －80 ℃下保存，备测。
                                                             gov/）、KEGG 数 据 库（https：//www. kegg. jp/）和 LIPID
             （3）非极性成分提取：取上述极性成分提取离心时
                                                             MAPS数据库（https：//www.lipidmaps.org/）对所得DEMs
          所得残渣，加入预冷的二氯甲烷-甲醇混合溶液（体积比
                                                             进行匹配，然后通过火山图、聚类热图对 DEMs 进行展
          3∶1）1.5 mL 重悬，于冰浴中匀浆，制备组织匀浆液。取
                                                             示 ；运 用 MetaboAnalyst  5.0 在 线 工 具（https：//www.
          该组织匀浆液，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取
                                                             metaboanalyst.ca/），以 P＜0.05 作为筛选条件，对 DEMs
          上清液，以氮气流吹干，即得非极性成分，于－80 ℃下保
                                                             进行通路富集分析，并进一步阐释关键代谢物（即实际
          存，备测。
                                                             检测到且与所得富集代谢通路相关的 DEMs）的生物学
             （4）样品处理：进样分析前，取上述极性、非极性成
                                                             意义。
          分样品分别用 50% 甲醇 120 µL 复溶，以 12 000 r/min离            3 结果
          心15 min后，取上清液，合并混匀，即得单只小鼠待测样
                                                             3.1 药效学分析结果
          品，备测。
                                                                 实验期间，CON 组小鼠毛发顺滑，健康状态良好；
          2.2.2 UHPLC-MS/MS分析条件
                                                             DOX组小鼠可见明显的萎靡不振、毛发稀疏等症状，体
              色谱条件如下：以Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，
                                                             重随给药次数增加整体呈下降趋势，饮食及活动量减
          1.9 µm）为色谱柱，以0.1%甲酸水溶液为流动相A、0.1%                   少；而GDOX组小鼠的精神状态较DOX组有所改善，体
          甲酸乙腈溶液为流动相 B 进行梯度洗脱（0～3 min，                       重较 DOX 组有所增加，饮食及活动量也随之增加。各
          99%A；3～5  min，99%A→55%A；5～13  min，55%A→            组小鼠的体重变化曲线见图1A。
          20%A；13～15  min；20%A→1%A；15～18  min，1%A；               与 CON 组比较，DOX 组小鼠血清中 AST、CK、CK-
          18～18.5 min，1%A→99%A；18.5～22 min，99%A）；柱温          MB、LDH 水平均显著升高（P＜0.05）；与 DOX 组比较，
          为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样体积为3 µL。                     GDOX组小鼠血清中上述指标水平（CK-MB除外）均显
              质谱条件如下：采用电喷雾电离源（electrospray ioni-             著降低（P＜0.05）。各组小鼠血清中AST、CK、CK-MB、
          zation，ESI）进行正、负离子扫描，扫描范围为 m/z 70～                 LDH水平变化情况见图1B。
          1 050；全扫描（full MS）分辨率为70 000，二级扫描（MS/              3.2 代谢组学分析结果
          MS）分辨率为17 500；鞘气流量为35 arb，辅助气体流量                   3.2.1 代谢轮廓分析结果
          为10 arb；毛细管温度为320 ℃；碰撞电压（多级模式）为                        PCA结果（图2）显示，CON组、DOX组、GDOX组小
          20、40、60 V；喷雾电压为 3.5 kV（正离子）和 2.5 kV（负             鼠心脏组织样品能明显区分，且组内样品均能较好地聚
          离子）。                                               集，说明3组代谢物明显不同。


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 661 ·
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