Page 32 - 《中国药房》2024年5期
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1.3 细胞                                              养液于新的 96 孔板内，再依次加入 Griess Reagent Ⅰ和
              小鼠小胶质 BV2 细胞购自无锡菩禾生物医药技术                        Ⅱ各 50 μL，利用酶标仪在 540 nm 波长处测定 OD 值。
          有限公司；人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞购自武汉普                        根据Griess试剂盒说明书，将NaNO2稀释成浓度分别为
          诺赛生物科技有限公司。                                         0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L的系列溶液，制作标
          2 方法                                                准曲线，检测细胞培养液中 NO 含量并计算药物对神经
          2.1 药物配制                                            炎症的抑制率，并根据抑制率计算出Cel、Cel-1、Cel-2对
              称取Cel、Cel-1、Cel-2各1.0 mg，分别溶于二甲基亚               神经炎症的 IC50。抑制率（%）＝[（模型组 OD－给药组
          砜溶液中，配制成浓度均为10 mmol/L的母液，于4 ℃冰                      OD）/（模型组OD－对照组OD）]×100%。
          箱中保存备用。临用前，用对应细胞模型所需的培养基                            2.3.3 Cel及其衍生物对BV2细胞培养液中炎症因子含
          稀释至所需浓度。                                            量的影响
          2.2 细胞培养                                                采用 ELISA 法进行检测。取对数生长期的 BV2 细
              将 BV2 细胞培养于含 10% 胎牛血清、1% 青链霉素                   胞，接种至 24 孔板中（细胞密度为 2×10  mL ，500
                                                                                                   5
                                                                                                        －1
          的 DMEM 高糖完全培养基中，将 SH-SY5Y 细胞培养于                     μL/孔）。实验分为对照组、模型组和 Cel 及其衍生物的
          含15%胎牛血清、1%青链霉素的MEM/F12完全培养基                        不同浓度组（给药浓度均为 0.156、0.313、0.625 μmol/L，
          中，2 种细胞均置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细                      根据“2.3.2”项下实验结果确定），每组设3个复孔。根据
          胞达到 80%～90% 的密度时，用 0.25% 胰蛋白酶进行消                   “2.3.2”项下方法进行造模，造模结束后，收集细胞培养
          化、传代，待细胞生长至对数生长期时可开展后续实验。                           液。按照ELISA试剂盒说明书操作，测定细胞培养液中
          2.3 抗神经炎症活性研究                                       TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。
          2.3.1 Cel及其衍生物对BV2细胞毒性的检测                           2.4 抗氧化损伤活性研究
              采用 CCK-8 法进行检测。收集 BV2 细胞，接种至                    2.4.1 Cel及其衍生物对SH-SY5Y细胞毒性的影响
                                   5
          96孔板中（细胞密度为1×10  mL ，100 μL/孔），于细胞                      采用 CCK-8 法进行检测。收集 SH-SY5Y 细胞，接
                                      －1
                                                                                                －1
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          培养箱中常规培养。实验设空白组（无细胞）、对照组                            种至 96 孔板中（细胞密度为 5×10  mL ，100 μL/孔），
         （含细胞不含药物）和 Cel 及其衍生物的不同浓度组（给                         于细胞培养箱中常规培养。分组、给药及后续处理方法
          药浓度均为 20、10、5、2.5、1.25、0.625 μmol/L，根据参考            参考“2.3.1”项。
                                             [4]
          文献中所报道的 Cel 给药浓度范围确定 ），每组设 5 个                      2.4.2 Cel及其衍生物对SH-SY5Y细胞存活率的影响
          复孔。加药/培养基继续培养24 h后弃上清液，每孔以换                             采用 CCK-8 法进行检测。取 SH-SY5Y 细胞，按照
          液形式加入含10% CCK-8的DMEM高糖培养基100 μL。 “2.4.1”项下细胞密度进行铺板，待细胞融合至培养皿
          培养 2 h 后，用酶标仪在 450 nm 波长处测定其光密度                     90% 左右的密度时即可更换为含药或不含药的 MEM/
         （optical density，OD）值，计算细胞抑制率，并通过细胞抑                 F12 培养基（含 1% 血清）。实验分为对照组、模型组和
          制率计算 Cel、Cel-1、Cel-2 对 BV2 细胞的半数抑制浓度                Cel 及其衍生物的不同浓度组（给药浓度均为 0.625、
         （median  inhibition  concentration，IC50 ）。 细 胞 抑 制 率  0.313、0.156、0.078、0.039 μmol/L，根据“2.4.1”项下实验
         （%）＝[（对照组OD－给药组OD）/（对照组OD－空白组                        结果确定），每组设 4 个复孔。给药组先给药干预 4 h。
          OD）]×100%。                                          除对照组外，其余各组均加入终浓度为 200 μmol/L 的
                                                                                          [12]
          2.3.2 Cel 及其衍生物对 BV2 细胞培养液中 NO 含量的                  H2O2刺激4 h，建立氧化损伤模型 。造模结束后弃上清
          影响                                                  液，每孔加入100 μL含10% CCK-8试剂的MEM/F12培
              采用Griess法进行检测。取BV2细胞，按照“2.3.1”                  养基。培养 4 h 后，用酶标仪在 450 nm 波长处测定 OD
          项下的细胞密度进行铺板，待细胞融合至培养皿80%左                           值并计算细胞存活率，并根据细胞存活率计算 Cel、Cel-
          右的密度时即可更换为含药或不含药的无血清 DMEM                           1、Cel-2 神 经 保 护 的 半 数 效 应 浓 度（median  effective
          高糖培养基。实验分为对照组、模型组和 Cel 及其衍生                         concentration，EC50 ）。细胞存活率（%）＝[（模型组OD－
          物的不同浓度组（给药浓度均为 0.625、0.313、0.156、                   给药组OD）/（模型组OD－对照组OD）]×100%。
          0.078、0.039 μmol/L，根据“2.3.1”项下实验结果确定），              2.5 衍生物 Cel-2 对 SH-SY5Y 细胞中凋亡相关蛋白表
          每组设4个复孔。给药组先给药干预4 h。除对照组外，                          达的影响
          其余各组均加入终质量浓度为1 μg/mL的LPS刺激24 h，                         采用Western blot法进行检测。取对数生长期的SH-
                                                                                                       6
                           [11]
                                                                                                           －1
          建立神经炎症模型 。造模结束后，移取 50 μL 细胞培                        SY5Y 细胞，接种至 6 孔板中（细胞密度为 1×10  mL ，
          · 538 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 5                               中国药房  2024年第35卷第5期
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