Page 25 - 《中国药房》2024年1期

tide，NADPH）转化为 NAD +[13] 。由此可知，丙酮酸是糖
PKM2 60 kDa
酵解途径的目标产物，更是细胞代谢的枢纽物质；并且
LDHA 32～37 kDa
其在缺氧的条件下会发酵生产终产物乳酸，完成糖酵解
全过程。因此，丙酮酸和乳酸的水平可较好地反映细胞
β-actin 42 kDa
糖酵解水平。本研究发现，经梓醇处理 72 h 后，细胞中
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
A. PKM2、LDHA蛋白
糖酵解产物丙酮酸、乳酸的分泌水平均降低，且具有一
p-STAT3 86 kDa 定的浓度依赖性趋势，这提示梓醇可下调 Th17 分化过
79 kDa
程中的细胞糖酵解。
STAT3 86 kDa
PKM2 是 PKs 的一种同工酶，通常在增殖细胞和肿
β-actin 42 kDa
瘤细胞中过表达，主要功能是调节糖酵解和瓦氏效应
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ （Warburg effect） 。PKM2 在活化的 CD4 T 细胞中的表
[9]
+
B. p-STAT3、STAT3蛋白
Ⅰ：对照组；Ⅱ：梓醇20 μg/mL组；Ⅲ：梓醇40 μg/mL组；Ⅳ：梓醇 达显著上调，这有助于糖酵解途径进入发酵和乳酸形成
80 μg/mL组。 的方向 ，是 Th17 细胞分化所必需的物质 。以往研究
[14]
[6]
图3 各组细胞中PKM2、LDHA、p-STAT3和STAT3蛋
显示，PKM2 与 Th17 细胞分化呈正相关，沉默或药理抑
白表达的电泳图
制PKM2可减少细胞糖酵解和在体外向Th17细胞分化，
表4 各组细胞中 PKM2、LDHA 蛋白表达和 STAT3 磷 而过表达 PKM2 可恢复 Th17 细胞分化 。LDHA 是
[15]
酸化水平测定结果（x±s，n＝3）
LDH 的一种亚基，负责将丙酮酸转化成乳酸，其在 RA
组别 PKM2/β-actin LDHA/β-actin p-STAT3/STAT3
对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 患者的滑膜组织中表达上调，诱导Th17细胞亚群极化；
梓醇20 μg/mL组 0.76±0.06 a 0.80±0.03 a 0.66±0.09 a LDHA能催化糖酵解产物丙酮酸转化为乳酸，修复氧化
梓醇40 μg/mL组 0.63±0.02 a 0.62±0.04 a 0.48±0.07 a 还原平衡，对Th17细胞的致病性分化至关重要 。在富
[16]
梓醇80 μg/mL组 0.53±0.03 a 0.39±0.05 a 0.37±0.05 a
乳酸环境中，效应细胞因子IL-17表达上调，Th17细胞效
a：与对照组比较，P＜0.05。
4 讨论 应功能增强。由于RA关节滑膜腔是一个相对缺氧的局
+
部微环境，导致CD4 T细胞从氧化磷酸化向糖酵解的代
体外联合使用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激T细
谢转换，这也意味着滑膜腔内倾向于乳酸积累，进而诱
胞，模拟T细胞活化的双信号作用，是进行T细胞激活与
+
导 CD4 T 细胞向致炎性的 Th17 细胞亚群持续分化，加
扩增的最普遍的方法。IL-23 对 Th17 细胞的生长、维持
[17]
重滑膜炎症 。通过调节 PKM2 介导的糖酵解抑制
具有重要意义，IL-23 受体在活化的 Th17 细胞中表达上
Th17细胞分化，以及通过抑制LDHA表达来降低糖酵解
[12]
调 。而 IL-6、TGF-β 是 Th17 分化的关键细胞因子；IL-
通量，从而减少病灶乳酸堆积可能是治疗 RA 这一类自
6 可通过 STAT3 信号通路促进 Th17 转录调节因子的表
身免疫性疾病的有效策略。本研究检测了梓醇对 Th17
+
[12]
达，从而使CD4 T细胞定向分化为Th17谱系 。因此，
细胞分化比例及细胞中PKM2、LDHA蛋白表达的影响，
本研究在建立Th17细胞分化模型时，选择IL-6、IL-23以
结果发现，不同质量浓度梓醇均可显著降低细胞中Th17
及低浓度的TGF-β作为刺激因子。研究结果表明，培养
细胞分化比例，并可下调细胞中 PKM2、LDHA 的表达，
72 h可使该模型中Th17细胞达到可观的分化比例，说明
这提示梓醇抑制Th17细胞分化的作用可能是通过抑制
体外诱导 Th17 细胞定向分化模型造模成功，为后续实
PKM2和LDHA的表达来实现的。
验研究确定了体外诱导 Th17 细胞分化、培养的条件。 STAT3信号对Th17细胞的发育至关重要。Th17细
进一步分组实验显示，与对照组比较，梓醇 20、40、80
胞分化受 IL-6/IL-23 信号介导的 STAT3 磷酸化调控，
μg/mL 组细胞中 Th17 细胞分化比例显著降低，表明梓 STAT3 激活（即 STAT3 发生磷酸化）可导致 Th17 特异性
醇可抑制Th17细胞分化与分泌活性。上述结果与本课 转录因子 RORγt 的表达；同时，RORγt 在应答 STAT3 的
[9]
题组前期动物实验结果一致 ，但其具体机制仍需探索。 过程中又会促进 Th17 细胞分化和细胞因子表达，进而
丙酮酸激酶（pyruvate kinases，PKs）是葡萄糖代谢 诱导炎症发生 。据文献报道，PKM2 可促使 STAT3 发
[18]
过程涉及的一个重要酶，其将腺苷二磷酸和磷酸烯醇式 生磷酸化，进而诱导IL-17的表达，而IL-17是Th17细胞
丙酮酸不可逆转地催化为腺苷三磷酸和丙酮酸。在低 分泌的最重要的效应物 。因此，本研究还检测了梓醇
[19]
氧环境下，丙酮酸被细胞质中的LDH发酵成乳酸，并将 对细胞中 STAT3 磷酸化水平以及 RORγt mRNA 表达的
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleo‐ 影响，结果发现，梓醇下调了细胞中 STAT3 磷酸化水平

中国药房 2024年第35卷第1期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 1 · 19 ·