Page 23 - 《中国药房》2024年1期
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2.2 Th17细胞分化模型的建立及分组处理                             2.4 细胞培养上清液中丙酮酸、乳酸水平检测
          2.2.1 Th17细胞分化模型的建立                                    采用比色法检测细胞培养上清液中丙酮酸、乳酸水
                                +
              将分选后的naive CD4  T细胞培养于含20%胎牛血                  平。取“2.2.2”项下处理后细胞，收集培养基的上清液，
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          清的RPMI 1640培养基中，分别以2×10 个/孔的密度接                    严格按相应试剂盒说明书操作，测定细胞培养上清液中
          种于 24 孔板中[24 孔板中应提前 4 h 包被终质量浓度为                   糖酵解代谢产物丙酮酸、乳酸水平。
          2 μg/mL 的抗 CD3 抗体和抗 CD28 抗体（每孔总体积 1                2.5 细胞中RORγt、PKM2、LDHA mRNA表达检测
          mL）]。实验设Th0组、Th24组、Th48组和Th72组，每组                      采用实时荧光定量-逆转录聚合酶链式反应（qRT-
          设3个复孔。Th24组、Th48组、Th72组每孔均分别加入                     PCR）法检测细胞中RORγt、PKM2、LDHA mRNA表达。
          定向分化刺激剂白细胞介素 6（interleukin 6，IL-6）、IL-             取“2.2.2”项下处理后细胞，采用 Trizol 法提取细胞中总
          23、转 化 生 长 因 子 β（transforming  growth  factor  beta，  RNA，逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩
          TGF-β）至其终质量浓度分别为 25、20、5 ng/mL，并于                  增。反应体系（共 20 μL）如下：ChamQ Universal SYBR
          37 ℃、5%CO2环境下分别培养24、48、72 h，以诱导naive               qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各
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          CD4  T细胞向Th17细胞分化；Th0组细胞不进行极化处                     0.4 μL，cDNA模板2 μL，焦碳酸二乙酯水7.2 μL。反应
                                         +
          理。采用流式细胞术检测 naive CD4  T 细胞中 Th17 细                条件如下：95 ℃预变性5 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延
          胞分化比例。                                             伸30 s，共40个循环。以GAPDH 为内参，采用2               －△△Ct 法
          2.2.2 梓醇给药后Th17细胞的分组及处理                            计算各目的基因 mRNA 的表达量。引物序列采用
                                +
              将分选后的naive CD4 T细胞培养于含20%胎牛血                   Primer 5.0 软件设计，由生工生物工程（上海）股份有限
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          清的RPMI 1640培养基中，分别以2×10 个/孔的密度接                    公司合成，详细信息见表1。
          种于 24 孔板中[24 孔板中应提前 4 h 包被终质量浓度为                           表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          2 μg/mL 的抗 CD3 抗体和抗 CD28 抗体（每孔总体积 1                 基因名称       引物序列（5′→3′）                扩增产物长度/bp
          mL）]。实验设对照组（0 μg/mL）和梓醇20、40、80 μg/mL               LDHA       上游：CTGTGGCAGACTTGGCTGAGAG     156
                                                                         下游：TCACCTTCACAACATCCGAGATTCC
          组（浓度参考文献[11]和本课题组前期预实验结果设                           RORγt      上游：ACAAATTGAAGTGATCCCTTGC     127
          置），每组设 9 个复孔。每孔分别加入定向分化刺激剂                                     下游：GGAGTAGGCCACATTACACTG
                                                              PKM2       上游：TGTCTGGAGAAACAGCCAAG       105
          IL-6、IL-23、TGF-β 至其终质量浓度分别为 25、20、5
                                                                         下游：CGAATAGCTGCAAGTGGTAGA
          ng/mL，于37 ℃、5%CO2环境下培养72 h。取每组的3个                   GAPDH      上游：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG      123
          复孔，用于细胞培养上清液中丙酮酸、乳酸水平和 Th17                                    下游：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
          细胞分化比例检测；另取每组的 3 个复孔，用于细胞中                         2.6 细胞中PKM2、LDHA、STAT3、p-STAT3 蛋白表达
          PKM2、LDHA、视黄酸相关孤儿受体 γt（retinoid-related            检测
          orphan nuclear receptor gamma t，RORγt） mRNA 表达的        采 用 Western  blot 法 检 测 细 胞 中 PKM2、LDHA、
          检测 ；取各组剩下的 3 个复孔，用于细胞中 PKM2、                       STAT3、p-STAT3 蛋白表达情况。收集“2.2.2”项下处理
          LDHA、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的检测。                       后细胞，加入适量蛋白裂解液试剂（含磷酸酶抑制剂和
          2.3 Th17细胞分化比例检测                                   蛋白酶抑制剂）在冰上裂解30 min，然后在4 ℃下以12 000
              采用流式细胞术检测Th17细胞分化比例。分别取                        r/min离心30 min，分离上清，采用BCA法检测上清液中
         “2.2.1”“2.2.2”项下处理后细胞，按细胞量每孔分别加入                    总蛋白浓度，并将蛋白进行高温变性。取 20 μg 变性蛋
          Leukocyte Activation Cocktail 抗体，于 37 ℃、5%CO2 环    白进行8%聚丙酰胺凝胶电泳（电压150 V，电泳时间60
          境 下 继 续 孵 育 4  h。 收 集 细 胞 并 用 磷 酸 盐 缓 冲 液          min）分离，电泳完成后转移至0.45 μm PVDF膜（转膜电
         （phosphate-buffered saline，PBS）清洗 1 次。加入 1 μL       流400 mA，转膜时间60 min）上，然后用5%牛血清白蛋
          CD4-FITC抗体室温避光孵育30 min，以PBS清洗；加入                   白溶液室温封闭 1 h；洗膜后分别加入 PKM2、LDHA、
          1 mL BD细胞固定/渗透试剂室温避光孵育20 min后，用                    STAT3、p-STAT3、β-actin 一抗（稀释度分别为 1∶1 000、
          1 mL BD渗透/洗涤试剂清洗；加入2 μL IL-17A-PE流式                1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育过夜；用
          抗体室温避光孵育 40 min 后，用 1 mL BD 渗透/洗涤试                 TBST 缓冲液洗膜 3 次，加入二抗（稀释度为 1∶20 000），
          剂清洗；加入 500 μL PBS 重悬细胞（细胞密度为 2×10              5   室温孵育 1 h；用 TBST 缓冲液洗膜 3 次，采用增强化学
          个/mL），置于流式细胞仪上检测Th17细胞分化比例，并                       发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色系统检
          使用Flow Jo V10软件进行结果分析。                             测目的蛋白的表达情况，采用 Image Lab 软件进行灰度


          中国药房  2024年第35卷第1期                                                  China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 1    · 17 ·
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