Page 22 - 《中国药房》2024年1期
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症性和自身免疫性疾病的发生发展，如多发性硬化症、                            盒 、预 混 液 形 式 的 高 效 RT-PCR 试 剂（批 号 分 别 为
          炎症性肠病、RA等       [3—4] 。Th17细胞在分化形成及功能执              027E2232EA、7E703F3）均购自南京诺唯赞生物科技股
          行过程中的代谢模式趋向于糖酵解，故抑制CD4 T细胞                          份有限公司；Leukocyte Activation Cocktail 抗体（批号
                                                   +
          的糖酵解能有效减少Th17细胞的形成 。                                2026781）购自上海优宁维生物科技股份有限公司；BD
                                           [3]
              丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）是糖酵             细 胞 固 定/渗 透 试 剂 、BD 渗 透/洗 涤 试 剂 、白 细 胞 介
          解最后一个步骤的限速酶，在糖酵解过程中起着重要的                            素 -17A- 藻 红 蛋 白（interleukin-17A-phycoerythrin，IL-
              [5]
          作用 。研究显示，PKM2 在活化的 CD4 T 细胞中显著                      17A-PE）抗体（批号分别为 1361481、2028447、2017782）
                                             +
                                                  [6]
          上调，其是促炎性Th17细胞分化所必需的物质 。乳酸                          均购自美国 BD Pharmingen 公司；荧光素标记的 CD4-
          脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解最            FITC 抗体（批号 2410094）购自美国 EB 公司；丙酮酸测
          后一个步骤中的关键酶，可催化丙酮酸转化为乳酸，而                            试盒、乳酸测试盒（批号分别为 20230213、20230211）均
                                              [7]
          在RA期间，乳酸积累可抑制炎症免疫反应 。                               购自南京建成生物工程研究所；兔源PKM2、磷酸化信号
              地黄为玄参科地黄属植物地黄 Rehmannia gluti‐                  转导和转录激活因子 3（phosphorylated signal transducer
          nosa Libosch.的新鲜或干燥块根，前者习称“鲜地黄”，后                   and activator of transcription 3，p-STAT3）、STAT3 单克隆
          者习称“生地黄”。生地黄清热凉血、养阴生津，可用于
                                                              抗体（批号分别为 4053T、9145T、12640S）均购自美国
          治疗热入营血、热病伤阴、津伤便秘、阴虚发热等证。梓
                                                              CST公司；兔源LDHA单克隆抗体（批号00102198）购自
          醇是生地黄中的主要活性成分，属于环烯醚萜苷类化合
                                                              美国Three Eagles公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆
          物，具有抗氧化、抗炎、调控葡萄糖稳态、改善糖代谢、抑
                                                              抗体（批号 12w2944）购自美国 Affinity Biosciences 公
                               [8]
          制肿瘤能量代谢的功能 。本课题组前期研究发现，梓
                                                              司 ；辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 山 羊 抗 兔 二 抗（批 号
          醇可明显下调胶原诱导关节炎（collagen-induced arthri‐
                                                              234750512）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
          tis，CIA）模型小鼠 Th17 细胞的分化及分泌活性，改善
                                                              1.3 动物
          Th17 细胞异常分化，减少炎症因子分泌，进而改善 CIA
                                                                  本研究所用动物为 6～8 周龄的 SPF 级健康雄性
                      [9]
          小鼠关节炎症 。该结果提示，梓醇可能通过介导Th17
                                                              C57BL/6小鼠，共10只，购自杭州医学院，实验动物生产
          细胞的生成来缓解 RA 病情。此外，本课题组前期研究
                                                              许可证号为 SCXK（浙）2019-0002。实验动物购入后在
                                     +
          还发现，梓醇能够显著影响CD4  T细胞中糖酵解代谢产
                                                              南京中医药大学实验动物中心饲养，饲养期间自由摄
                [10]
          物水平 。据此，本研究在前期研究基础上，拟进一步
                                                              食、饮水，遵循自然昼夜节律。饲养中心室温为（23±
          建 立 Th17 细 胞 体 外 分 化 模 型 ，探 讨 梓 醇 通 过 干 预
                                                              2） ℃，相对湿度为40%～60%。南京中医药大学动物伦
          PKM2/LDHA表达影响Th17细胞糖酵解，从而调控细胞
                                                              理委员会审核并批准了本研究所有动物实验操作，伦理
          分化的可能机制，为发现 RA 等慢性复杂性疾病新的治
                                                              编号为202103A010。
          疗策略提供参考。
          1 材料                                                2 方法
                                                              2.1 小鼠naive CD4  T细胞分选
                                                                               +
          1.1 主要仪器
                                                                  取健康 C57BL/6 小鼠，将其脱颈椎处死，置于预定
              Gallios分析型流式细胞仪购自美国Beckman公司；
          Roche LightCycler96 型实时荧光定量 PCR 仪购自瑞士               量的 75% 乙醇中浸泡至少 15 min。在无菌环境下解剖
                                                                                                         +
          Roche 公司；M200Pro 型酶标仪购自瑞士 Tecan 公司；                 小鼠，取脾脏制备单个核细胞悬液，按照naive CD4 T细
          Bio-RAD ChemiDoc XRS+型成像系统购自美国Bio-Rad               胞分选试剂盒说明书操作，依次加入 MACS 分选缓冲
          公司；Micro 21R 型高速冷冻离心机购自美国 Thermo                    液、Biotin-Antibody Cocktail 磁珠，于 4 ℃条件下避光孵
          Fisher Scientific公司；autoMACS Pro型全自动磁珠分选            育5 min。随后依次加入MACS分选缓冲液、Anti-Biotin
          仪购自德国Miltenyi公司。                                    磁珠、CD44磁珠，于4 ℃条件下避光孵育10 min，每隔5
          1.2 主要药品与试剂                                         min吹弹1次。打开autoMACS全自动磁珠分选仪，设置
              梓醇对照品（批号 J07GB150957，纯度≥98%）购自                  阴性选择程序，将上述含免疫磁珠的细胞悬液加到 LS
                                                 +
          上海源叶生物科技有限公司；小鼠 naive CD4  T细胞分                     柱中，收集柱下流出的液体。重复上述分选操作3次，合
          选 试 剂 盒 、MACS 分 选 缓 冲 液 、LS 柱（批 号 分 别 为             并分选液后离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用含20%
                                                                                                           +
          5221105782、7211100380、5220124006）均购自德国 Mil-         胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬并计数naive CD4  T
                                                                                            6
          tenyi 公司；通用型高灵敏度染料法定量 PCR 检测试剂                      细胞，调整细胞密度为（0.5～1）×10 个/mL。

          · 16 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 1                                中国药房  2024年第35卷第1期
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