Page 40 - 《中国药房》2023年23期
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12 h（早上 7：00 至晚上 19：00）和黑暗 12 h（晚上 19：00            2.5 小鼠肝脏组织中炎症因子mRNA表达水平的检测
          至早上 7：00）循环中饲养。小鼠适应性喂养 2 周后，进                           采用 TRIzol 试剂从小鼠肝脏组织中分离总 RNA，
          行后续实验。本次动物实验经中国科学院大学深圳医                             再将其逆转录为 cDNA，以 cDNA 为模板进行荧光定量
          院伦理委员会批准（批准号为LL-KT-2021062）。                        PCR。采用 2   －ΔΔCt  法，以 Actb 为内参，计算 IL-6、IL-1β、
              高脂肪饲料（蛋白质 20%、脂肪 60%、碳水化合物                      TNF-α 的 mRNA 表达水平。引物序列及扩增产物长度
          20%）购自戴茨生物科技（无锡）有限公司。                               见表1。
          2 方法                                                          表1 引物序列及扩增产物长度
          2.1 动物分组、造模与给药                                      基因名称         引物序列（5′→ 3′）             扩增产物长度/bp
                                                              IL-6         上游引物：TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC    76
              将30只小鼠随机分为3组，每组10只：正常组（简写                                    下游引物：TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC
          为“NFD 组”）饲喂普通饲料和饮用水，模型组（简写为                         IL-1β        上游引物：CCGTGGACCTTCCAGGATGA   117
                                                                           下游引物：GGGAACGTCACACACCAGCA
         “HFD 组”）和异甘草素组（简写为“ISL 组”）饲喂高脂饲
                                                              TNF-α        上游引物：CCACCATCAAGGACTCAA     162
          料 19 周建立 NAFLD 模型。根据前期研究与本次研究                                    下游引物：CAGGGAAGAATCTGGAAAGG
          目的，在造模同时，ISL 组按 100 mg/kg 灌胃异甘草素 ，                  Actb         上游引物：CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT   100
                                                        [8]
                                                                           下游引物：TGGCATAGAGGTCTTTACGG
          其余各组灌胃等量超纯水，每日1次，然后每周测定小鼠
                                                              2.6 小鼠粪便的16S rRNA测序
          体重。在实验过程中，NFD 组和 HFD 组小鼠因同笼打
                                                                  将收集的各组小鼠粪便样本进行 16S rRNA 测序。
          斗均死亡2只。在实验最后一天，收集小鼠粪便，液氮速
                                                              采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，扩增16S rRNA
          冻，然后于－80 ℃保存备用；随后禁食18 h，摘眼球取血
                                                              基因 V3-V4 区，纯化扩增子，制备测序文库，进行 Illu‐
          后颈椎脱臼处死。取小鼠白色脂肪（腹股沟脂肪和附睾
                                                              mina 测序分析，原始数据经过拼接质控后生成 OTUs
          脂肪）和棕色脂肪组织、肝脏和结肠组织，分别称重，计
                                                             （operational taxonomic units）聚类。将样品进行区分后
          算器官指数，器官指数＝器官质量/体重；组织样本液氮
                                                              基于美吉生物云平台（https：//www.majorbio.com）进行
          速冻，然后于－80 ℃保存，或以4%多聚甲醛进行固定，
                                                              OTUs 聚类分析和物种分析。根据分类信息，可以在不
          用于后续实验。所有动物实验操作均符合实验伦理。
                                                              同的分类层次上统计分析群落结构，然后对各组 OTUs
          2.2 小鼠肝脏组织、结肠组织的病理变化及肝脏脂质堆
                                                              聚类进行β多样性分析（主成分分析和主坐标分析）、物
          积情况观察
                                                              种组成分析（形成群落组成 Bar 图）、LEfSe 多级物种差
              将小鼠肝脏或结肠组织置于 4% 多聚甲醛中固定
                                                              异判别分析等，同时制作属水平群落热图等。
          24 h，经过脱水、石蜡包埋、组织梯度脱水等操作后，使用
                                                              2.7 小鼠各项指标与肠道菌群丰度的 Spearman 相关
          切片机进行切片，再进行苏木素-伊红（HE）染色，以甘油
                                                              性分析
          封片后在显微镜下观察并置于切片扫描仪中扫描，观察
                                                                  将每只小鼠的各项检测参数（包括体重，肝脏质量，
          肝脏或结肠组织的病理形态，然后根据肝脏病理改变计
                                                              肝指数，血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，肝脏中 TC 水
          算 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 活 动 评 分（NAFLD  activity
                                                              平，血清中 TC、ALT 水平）与候选菌属的相对丰度导入
          score，NAS）。取冷冻的小鼠肝脏组织进行切片，待切片
                                                              SangerBox 软件中的相关分析工具进行 Spearman 相关
          干燥后在10%多聚甲醛中固定15 min；以蒸馏水轻轻漂                        性分析，导出相关性热图，红色代表正相关，绿色代表负
          洗，在60%异丙醇溶液中浸洗5 min，然后置于油红O染                        相关，颜色越深代表相关性越大。
          色液中染色 15 min；以蒸馏水漂洗染色液，再置于苏木                        2.8 小鼠结肠组织中肠屏障功能相关蛋白表达水平的
          素染色液中浸染30 s；以蒸馏水洗净染色液，经甘油封片                         检测
          后扫描，观察肝脏脂质积累情况（脂质被染成红色），并                               称取各组小鼠（3 只）结肠组织适量进行匀浆，于
          使用Image-Pro Plus 6.0软件计算脂质染色面积占比。                   4 ℃下以12 000 r/min离心15 min；取上清液，用BCA蛋
          2.3 小鼠肝脏组织或血清中脂质与肝功能指标的检测                           白检测试剂盒测定其浓度并加热变性。取蛋白样品进
              取各组小鼠部分肝脏组织进行匀浆，作为肝脏组织                          行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳，再转移到PVDF
          样品。将小鼠全血以 3 000 r/min 离心，取上清液，作为                    膜上，室温封闭并于特定的一抗（Claudin-4、Occludin、
          血清样品。取上述两种样品，根据试剂盒说明书方法，                            ZO-1的稀释度均为1∶1 000，β-actin的稀释度为1∶10 000）
          检测肝脏组织或血清中TC、TG、ALT和AST的水平。                         中孵育过夜，然后用特异性二抗进行印迹。采用化学发
          2.4 小鼠血清中炎症因子水平的检测                                  光检测试剂盒检测免疫反应性，以 β-actin 为内参，采用
              取“2.3”项下血清样品，根据试剂盒说明书方法，检                       Image J软件进行分析，以目的蛋白与内参的灰度值比值
          测小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。                          表示其表达水平。实验重复3次。


          · 2850 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 23                            中国药房  2023年第34卷第23期
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