Page 35 - 《中国药房》2023年23期
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表1 引物序列                           醇定容摇匀得混合对照品储备液。精密量取混合对照
          目标基因          引物序列（5′→3′）               产物长度/bp    品储备液 1 mL，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容摇匀
          β-actin       上游：CACTTTCTACAATGAGCTGCG    148      即得混合对照品溶液。
                        下游：CTGGATGGCTACGTACATGG
          IL-1β         上游：TGCAGGCTTCGAGATGAAC      149      2.2.3 供试品溶液的制备
                        下游：GGGATTTTGTCGTTGCTTGTC                 取三色散凝胶贴膏，除去盖衬，剪成0.5 cm×0.5 cm
          TNF-α         上游：CTTCTCATTCCTGCTCGTGG     142      小块，称取 12 g，置于圆底烧瓶中，加入氢氧化钠溶液 3
                        下游：TGATCTGAGTGTGAGGGTCTG
          IL-6          上游：AAGCCAGAGTCATTCAGAGC     148      mL，静置30 min，加入三氯甲烷50 mL，加热回流4 h；过
                        下游：GTCCTTAGCCACTCCTTCTG              滤后将滤液转移至 50 mL 容量瓶中，使用三氯甲烷定
              结果（图5）显示，与空白组比较，模型组大鼠滑膜组                       容；精密吸取5 mL上述溶液，转移至10 mL容量瓶中，加
          织中 IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平均显著增加                 甲醇定容摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取滤液，即得。
         （P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠滑膜组织中IL-                      2.2.4 空白溶剂的制备
          1β、TNF- α、IL-6  mRNA 表 达 水 平 均 显 著 降 低（P＜              量取5 mL三氯甲烷于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释
          0.05）；与传统工艺组比较，醇提组大鼠滑膜组织中 IL-                      定容，即得空白溶剂。
          1β、IL-6 mRNA表达水平均显著降低（P ＜0.05），水提组                 2.2.5 方法学考察
          大 鼠 滑 膜 组 织 中 IL-6  mRNA 表 达 水 平 显 著 降 低               参照 2020 年版《中国药典》（四部）通则分析方法验
         （P＜0.05）。                                           证指导原则进行方法学考察。取供试品溶液、混合对照
           15                                                品溶液和空白溶剂，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，
                                         a
                                                    空白组      结果显示，空白溶剂对士的宁、马钱子碱、蔓荆子黄素的
           mRNA相对表达量  a                    bc  b  bc  醇提组    检测无干扰，供试品溶液（去蔓荆子）中其他成分对蔓荆
                                                    模型组
           10
                                                    传统工艺组
                                                             子的检测无干扰，供试品溶液（去马钱子）中其他成分对
                                                    水提组
            5
                   bc  b  b  a                               士的宁、马钱子碱的检测无干扰（图略）。分别精密吸取
                               b  b  b
                                                             1、2、3、4、6 mL 混合对照品溶液于 20 mL 容量瓶中并定
            0                                                容，摇匀后以0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.2.1”项下色谱
                  IL-1β                             TNF-α                                IL-6
             a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与传统工          条件进样检测，以各对照品的浓度（X）和峰面积（Y）进
         艺组比较，P＜0.05。                                        行线性回归，计算得到蔓荆子黄素的线性方程为 Y＝
         图5 各组大鼠滑膜组织中 IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA
                                                             61 712X－1 516.5（相关系数为 0.996 6），士的宁的线性
               表达结果（x±s，n＝5）
                                                             方程为 Y＝227 306X－7 905.4（相关系数为 0.998 4），马
          2.2 蔓荆子黄素、士的宁和马钱子碱含量测定方法的建立                        钱子碱的线性方程为 Y＝192 323X－2 230.4（相关系数

          2.2.1 色谱条件                                         为 0.999 5），结果表明蔓荆子黄素在 0.12～0.72 μg/mL
              色谱柱为Kromasil-5-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），       范围内、士的宁在 0.34～2.04 μg/mL 范围内、马钱子碱
          以0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度                         在 0.16～0.96 μg/mL 范围内均有良好的线性关系。蔓
          洗 脱（0～15  min，90%A；15～25  min，90%A→55%A；           荆子黄素、士的宁、马钱子碱的精密度、重复性、稳定性
          25～40 min，55%A；40～50 min，55%A→10%A；50～60          （24 h）的 RSD 均小于 15%（n＝6）。蔓荆子黄素、士的
          min，10%A；60～61  min，10%A→90%A；61～75  min，          宁、马钱子碱平均加样回收率分别为 91.46%、96.28%、
          90%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为258 nm；进样体                104.16%，RSD分别为6.1%、4.4%、3.8%（n＝6）。
          积为10 μL；柱温为30 ℃。                                   2.3 三色散凝胶贴膏原料药提取工艺的优化
          2.2.2 混合对照品溶液的制备                                   2.3.1 正交试验优化筛选
              精密称取士的宁对照品13.6 mg，置于10 mL容量瓶                       依据前期单因素实验结果，确定使用三色散细粉
          中，加甲醇溶解并定容摇匀，得 1.36 mg/mL 士的宁储备                   （300目）和55%乙醇进行正交试验。选取加醇倍数（A）、
          液；精密称取马钱子碱对照品 12.8 mg，置于 20 mL 容量                  提取时间（B）、提取次数（C）、空白（D）作为考察因素，以
          瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，得 0.64 mg/mL 马钱子碱                    主要成分蔓荆子黄素（X）、马钱子碱（Y）、士的宁（Z）的含
          储备液；精密称取蔓荆子黄素对照品 12.0 mg，置于 25                     量作为评价指标，进行 L9 （3）正交试验。因素水平见表
                                                                                     4
          mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，得0.48 mg/mL蔓                     2。以综合评分进行统计学分析，综合评分＝蔓荆子黄
          荆子黄素储备液。分别精密量取蔓荆子黄素、士的宁、                           素+马钱子碱+士的宁总分的归一化处理值。正交试验
          马钱子碱储备液各 2.5 mL，置于 50 mL 容量瓶中，加甲                   设计与正交试验直观分析见表 3，醇提工艺的影响因素


          中国药房  2023年第34卷第23期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 23    · 2845 ·
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