Page 40 - 《中国药房》2023年18期
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2.2 大鼠粪便含水量检测                                       2.7 大鼠结肠组织中NGF、TrkA蛋白表达检测
              给药期间，每天清理大鼠粪便；末次给药结束后，将                             采用Western blot法进行检测。从“2.5”项下冻存的
          大鼠放入代谢笼中，收集其排泄的新鲜粪便并置于无菌                            每组样品中选取剩余5只小鼠的结肠组织样品，放入匀
          管中称重（即新鲜粪便质量）；随后，将粪便干燥 24 h                         浆器中，加入蛋白裂解液匀浆并提取总蛋白，以BCA测
         （80 ℃），再次称重（即干燥粪便质量）并按下式计算粪便                         定法进行蛋白定量后再作变性处理。取变性蛋白适量，
          的含水量：含水量＝（新鲜粪便质量－干燥粪便质量）/新                          以 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，
          鲜粪便质量×100%。                                         转移至聚偏二氟乙烯膜上，然后以 5% 脱脂奶粉于 4 ℃
          2.3 大鼠血清中5-HT含量检测                                   下封闭过夜；加入 NGF、TrkA、GAPDH 一抗（稀释比例
              采用ELISA法进行检测。粪便含水量检测结束后，                        分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶2 500），室温孵育2 h；加入相
          将大鼠用 1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，于腹主动脉                     应二抗（稀释比例为 1∶1 000），室温孵育 2 h；再以 ECL
          采血 2 mL，离心后分离上层血清，置于－20 ℃保存，备                       试剂避光显色后，于全能成像系统下成像。以 GAPDH
                                                              为内参，使用Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。
          用。取各组大鼠上述血清样品，采用ELISA法以酶标仪
                                                              2.8 统计学方法
          检测其5-HT含量。严格按照相应试剂盒说明书操作。
                                                                  利用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。
          2.4 大鼠肠道炭末推进率检测
                                                              计量资料均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分
              采用炭末推进法进行检测。采血后，从每组大鼠中
                                                              析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          随机选取5只，禁食不禁水24 h后，灌胃5%活性炭和4%
          阿拉伯胶混悬液（二者体积比1∶2）10 mL/kg；30 min后，                  3 结果
                                                              3.1 CDPS对大鼠粪便含水量的影响
          用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，以颈椎脱位法处死，
                                                                  与对照组比较，模型组大鼠的粪便含水量显著降低
          打开腹腔取出完整的肠道组织，平放在吸水纸上，测量
                                                             （P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠的粪便含水量
          肠管长度（即小肠全长）和幽门至炭末前沿的距离并按
                                                              均显著升高（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组
          下式计算炭末推进率：炭末推进率＝幽门至炭末前沿的
                                                              上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞
          距离/小肠全长×100%。
                                                              0.05）。结果见表2。
          2.5 大鼠结肠组织病理形态观察
                                                              表2 各组大鼠的粪便含水量、血清5-HT含量和炭末推
              采用 HE 染色法进行观察。将各组剩余大鼠用 1%
                                                                   进率比较（x±s）
          戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，以颈椎脱位法处死，取出
                                                              组别         粪便含水量（n＝20）/%  5-HT（n＝20）/（ng/mL）  炭末推进率（n＝5）/%
          其结肠组织于－80 ℃冻存。从每组样品中随机选取 5                          对照组          60.54±3.11   40.28±2.76  74.65±3.41
          只小鼠的组织样品，放入4%多聚甲醛中固定过夜，随后                           模型组          38.42±2.15 a  63.41±4.12 a  51.34±2.38 a
          行常规石蜡包埋、切片；切片以 HE 染色后，再以梯度乙                         阳性对照组        58.83±2.64 b  43.16±3.24 b  72.46±3.23 b
                                                              CDPS低剂量组     47.16±2.38 ab  55.62±3.41 ab  63.20±2.81 ab
          醇脱水、二甲苯透明，以中性树脂封片后，使用显微镜观                           CDPS高剂量组     59.21±2.93 b  42.83±3.32 b  73.79±3.26 b
          察各组大鼠结肠组织的病理形态。                                        a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。
          2.6 大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA表达检测                        3.2 CDPS对大鼠血清中5-HT含量的影响
              采用 qRT-PCR 法进行检测。从“2.5”项下冻存的每                       与对照组比较，模型组大鼠血清中 5-HT 含量显著
          组样品中随机选取另 5 只小鼠的结肠组织样品，利用                           升高（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠血清中
          Trizol 法提取 RNA，再利用反转录试剂将其反转录为                       5-HT含量均显著降低（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS
          cDNA；以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系包括：                    高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义
          2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（具体             （P＞0.05）。结果见表2。
          序列及产物长度见表 1）各 0.4 μL，cDNA 模板 1 μL，加                 3.3 CDPS对大鼠炭末推进率的影响
          ddH2O 至 20 μL。反应程序包括：95 ℃预变性 2 min；                     与对照组比较，模型组大鼠的炭末推进率显著降低
          95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH                （P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠的炭末推进率
          为内参，采用 2     －ΔΔCt  法计算大鼠结肠组织中 NGF、TrkA             均显著升高（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组
          mRNA的相对表达量。                                         上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞
                    表1 qRT-PCR引物及产物长度                         0.05）。结果见表2。
           目的基因        序列（5′→3′）                 产物长度/bp      3.4 CDPS对大鼠结肠组织病理形态的影响
           NGF         上游：GGCATTGACTCCAAGCAC        89            对照组大鼠的结肠组织结构完整，黏膜层腺体排列
                       下游：GTATCTATCCTGATGAACCTCC              整齐，无明显炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组大鼠
           TrkA        上游：TGGCAGCGTGAGCCGCAACA     124        的结肠组织黏膜肌层出现断裂，腺体紊乱，炎症细胞浸
                       下游：GCCCAGAACGTCCAGGTAA
           GAPDH       上游：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC      95        润和细胞水肿明显；与模型组比较，阳性对照组和CDPS
                       下游：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT                低、高剂量组大鼠的结肠组织形态逐渐恢复，黏膜层腺


          · 2210 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 18                            中国药房  2023年第34卷第18期
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