Page 39 - 《中国药房》2023年13期
P. 39

采用 Cu Kα 射线作为光源，波长为 1.540 6 Å，扫描角度                 CNA给药量一致）。肌内注射相应药物/溶剂；每天给药
          为 2θ，扫描范围为 5°～50°，扫描步长为 0.02°，扫描速度                 1 次，连续 14 d，给药体积为 10 μL/g。每天称定小鼠体
          为10°/min。                                          质量，并记录小鼠的死亡情况。
          2.4 黄体酮-CNA共晶的红外光谱检测                               2.7.2 小鼠血清及组织样本的采集及处理
              采用傅里叶变换红外光谱法检测黄体酮-CNA 共                          末次给药 12 h 后，所有小鼠均禁食不禁水 12 h，称
          晶、黄体酮及CNA的红外光谱。取上述样品各2 mg，分                        定其体质量后，摘眼球取血。取部分血样于EDTA-k2抗
          别置于玛瑙研钵中，加入干燥的溴化钾细粉200 mg作为                        凝管中用于血常规分析；其余血样于室温下静置 1 h 后
          分散剂，充分研磨混匀后，置于压片模具中制成供试片。                          在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，分离上层血清，用于
          设置扫描范围为4 000～450 cm 。                              生化指标检测。取血后，立即用颈椎脱臼法处死小鼠，
                                    －1
          2.5 黄体酮-CNA共晶的物相鉴别                                 打开其腹腔，于冰台上迅速取出肝脏、肾脏和子宫，用预
              采用差示扫描量热法检测黄体酮-CNA 共晶的物                        冷的生理盐水冲洗除去组织上的血渍，用滤纸吸去多余
          相。将2～3 mg黄体酮-CNA共晶置于盖上扎孔的氧化                        水分，称定各脏器的质量后，置于4%多聚甲醛溶液中固
          铝坩埚中，密封后进行分析。实验过程中，流速保持在                           定，备用。
          50.0 mL/min，加热速率保持在10 ℃/min。                       2.7.3 小鼠脏器指数的计算
          2.6 黄体酮-CNA共晶的溶出度考察
                                                               根据各组小鼠肝脏、肾脏、子宫的质量以及其“2.7.2”
          2.6.1 黄体酮含量测定方法的建立                                 中称定的末次体质量，计算各组小鼠的脏器指数：脏器
            采用高效液相色谱法进行黄体酮含量测定。色谱
                                                             指数（%）＝脏器质量（g）/小鼠体质量（g）×100％。
          条件为：采用Shim-pack GIST C18柱，以水（A）-乙腈溶液
                                                             2.7.4 小鼠血常规及血清中生化指标检测
         （B）（30∶70，V/V）为流动相进行等度洗脱；流速为 1
                                                               取“2.7.2”项下的抗凝血，使用全自动血液细胞分析
          mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；检测器为紫外检
                                                             仪检测血液中的血细胞数量及种类。采用微板法检测
          测器，检测波长为 241 nm。按照 2020 年版《中国药典》
                                                             小鼠血清中 ALT、AST 水平，采用比色法检测小鼠血清
         （四部）“通则9101”项下方法进行方法学考察 ，结果符
                                                [10]
                                                             中BUN水平，采用肌氨酸氧化酶法检测小鼠血清中CR
          合相关要求。
                                                             水平。具体操作严格按照相应试剂盒说明书进行，均使
          2.6.2 黄体酮-CNA共晶的溶出度检测
                                                             用酶标仪检测。
            按照2020年版《中国药典》（四部）“通则0931”项下
                                                             2.7.5 小鼠肝、肾、子宫组织的病理形态学观察
                                [10]
          溶出度测定方法进行测定 。具体方法如下：以纯净水
                                                               取“2.7.2”项下经固定的肝、肾、子宫组织适量，常规
          为溶出介质，在 100 mL 溶出介质中加入 30 mg 黄体酮、
                                                             制备石蜡切片（厚度为3 μm）后，行苏木精-伊红（HE）染
          与黄体酮单体相当量的黄体酮-CNA共晶以及黄体酮与
                                                             色，再经常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片
          CNA 的物理混合物（其中黄体酮与 CNA 的摩尔比为 1∶
                                                             后，使用显微镜观察各组小鼠肝、肾、子宫组织的病理形
          1）。设置转速为 100 r/min，溶出温度为 37 ℃。分别在
                                                             态学变化。
          5、10、15、20、30、40、60、90、120、180 min时取样（每个时
                                                             2.8 统计学方法
          间点取样3份），采用建立的高效液相色谱法测定溶液中
                                                                 采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。数据以
          黄体酮的浓度，并绘制溶出曲线。
                                                             x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          2.7 黄体酮-CNA共晶的体内毒性考察
                                                             比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          2.7.1 分组与给药
            将 48 只 KM 小鼠随机分为正常组、黄体酮组、CNA                     3 结果
          组和黄体酮-CNA 共晶低、中、高剂量组，每组 8 只。参                      3.1 黄体酮-CNA共晶的晶体结构检测结果
                                                    [11]
          考黄体酮肌内注射的临床给药剂量0.33～1 mg/kg ，按                         单晶X射线衍射分析结果表明，该共晶的化学计量
          照“千克体质量剂量折算系数法”进行换算，选择 6、                          式为C21H30O2 ·C6H5ClN2O2，相对分子量为487.02，晶体密
                                                                           3
          12.5、25 mg/kg作为黄体酮-CNA共晶的低、中、高给药剂                  度为 1.281 g/cm 。该晶体属于斜方晶系，空间群为
          量（分别为临床最大剂量的 0.42、0.88、1.77 倍），以含                  P212121。温度为 296.15 K 时，晶胞参数为：a＝7.721（3）
          0.1% 二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液（phosphate balanced               Å，b＝11.783（5） Å，c＝27.762（11） Å；α＝β＝γ＝90°，晶
                                                                                   3
          solution，PBS）溶解；正常组给予含 0.1% 二甲基亚砜的                 胞体积 V＝2 525.8（17） Å ，晶胞内不对称单位数 Z＝4，
          PBS 溶 液 ；黄 体 酮 组 给 予 16  mg/kg 黄 体 酮（与 黄 体         2θ角范围为1.47°～23.53°。衍射指标范围为：－8≤h≤
                                                                                                 2
          酮-CNA共晶高剂量组中黄体酮给药量一致）；CNA组给                        8，－13≤k≤12，－30≤l≤31。拟合优度F ＝0.950。
          予 9 mg/kg CNA 溶液（与黄体酮-CNA 共晶高剂量组中                      在晶体结构中可以观察到 2 种不同的分子间氢键


          中国药房  2023年第34卷第13期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 13    · 1569 ·
   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44