Page 46 - 《中国药房》2023年4期
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          经醋炙后在保持利尿作用的同时可降低毒性 ，然而其                            进行分析前室温解冻。
          减毒机制不太明确。代谢组学技术目前在病理机制和                             2.3 溶液的制备
          毒理研究中应用越来越广泛，通过对生物样品中相对分                            2.3.1 供试品溶液 用移液枪准确吸取200 μL尿液，加
          子质量小于1 000的内源性代谢物进行系统的定性定量                          入 800 μL 预冷的甲醇-乙腈-水溶液（4∶4∶2，V/V/V），涡
          分析，探索代谢物与机体生理、病理变化的相关性，以评                           旋混合，－20 ℃静置60 min，于4 ℃下14 000 r/min离心
          价生物体复杂体系相互作用，及内外因素刺激下的整体                            20 min，取上清液真空干燥；质谱分析时加入 100 μL 乙
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          动态代谢反应 。本实验通过超高效液相色谱串联四极                            腈-水溶液（1∶1，V/V）复溶，涡旋，于 4 ℃下 14 000 r/min
          杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Exactive-MS）代                   离心15 min，取上清液，即得。
          谢组学技术，研究甘遂醋炙前后对生理状态大鼠尿液中                            2.3.2 质控样本溶液 取空白组、生甘遂组、醋甘遂组
          内源性代谢物的影响，通过分析代谢物的不同表达及其                            样品等量混合后，按“2.3.1”项下方法制备成质控样本
          生物学意义，找出醋炙后甘遂减毒的作用靶点及通路，                            溶液。
          为探讨其炮制减毒机制提供参考。                                     2.4 UPLC-Q-Exactive-MS分析条件
          1 材料                                                2.4.1 色谱条件 采用 ACQUITY UPLC BEH C18 （100
          1.1 主要仪器                                            mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，以0.1%甲酸溶液（A）-
              本研究所用主要仪器有 AS3120A 型超声波清洗器                      乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～1 min，5%B；1～9
         （无锡江星清洗设备有限公司），FA2204B 型电子天平                         min，5%B→100%B；9～12  min，100%B；12～15  min，
         （上海精科天美科学仪器有限公司），Q-Exactive 型四极                      100%B→5%B）；柱温为 40 ºC；流速为 0.3 mL/min；进样
          杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、Ultimate 3000型超高效                    体积为5 μL；样品盘温度为4 ℃。
          液相色谱系统[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]等。                           2.4.2 质谱条件 分别采用电喷雾离子源（electron
          1.2 主要药品与试剂                                         spray ionization，ESI）下正、负离子模式进行检测。ESI
              甘遂药材（产地河南，批号101179）购自河南江正中                      条件如下：喷雾气为60 arb，辅助加热气为60 arb，气帘气
          药材有限公司，经黑龙江中医药大学中药资源学教研室                            为 30 arb，离子源温度为 320 ℃，喷雾电压为±3 500 V
          王振月教授鉴定为大戟科植物甘遂 E. kansui T.N.Liou                 （正、负两种模式）；质量扫描范围为80～1 200 Da；子离
          ex T.P.Wang的干燥块根；乙酸铵（批号BZ300102）、乙腈                 子分辨率为17 500；一级质谱扫描频率为0.20 spectra/s，
         （批号011-0052）、甲醇（批号007-1623）均购自德国默克                   子离子扫描频率为 0.05 spectra/s；二级质谱采用信息依
          公司；水为蒸馏水。                                           赖性获取（information-dependent acquisition，IDA）获得，
          1.3 实验动物                                            并且采用 high sensitivity 模式，锥孔电压为±60 V（正、
              24只雄性SPF级SD大鼠，体质量为（200±20）g，购                   负两种模式），碰撞能量为（35±15）eV，IDA设置为排除
          自长春市亿斯实验动物技术有限公司，动物生产许可证                            4 Da以内的同位素，每个周期监测6个候选离子。
          号为SCXK（吉）2018-0007，实验动物福利与伦理审查编                     2.5 样品分析
          号为 HSDYXY-2021003。大鼠饲养在温度为 22 ℃，相                       质控样本用于测定仪器状态及平衡色谱-质谱系
          对湿度为 40% 左右，8：00 到 20：00 灯光照明的环境中，                  统，评价整个实验过程中系统稳定性。为避免仪器检测
          标准大鼠饲料喂养，自由饮水，在代谢笼中适应1周之后                           信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续
          开始实验。                                               分析，在样本队列每组样品后插入质控样本，从而监测
          2 方法                                                和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。按照“2.4”
          2.1 供试品药液制备                                         项下分析条件进行正、负离子交替模式全扫描。
              取甘遂药材，按2020年版《中国药典》（四部）醋炙法                      2.6 数据处理
                    [5]
         （通则0213） 进行炮制。将甘遂生品和炮制品分别打粉                              将质谱采集得到的原始数据经过 Compound Dis‐
          过 4 号筛，以 0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液配制                   coverer 3.0 软件进行峰提取、峰对齐、峰校正、标准化等
          成质量浓度为85 mg/mL的药液          [2，6] ，作为供试品药液。          数据前处理。输出由样本名称、谱峰信息（包括保留时
          2.2 实验动物分组、给药及尿液样品采集                                间和分子量）及峰面积组成的三维数据矩阵。代谢物结
              取 24 只大鼠，随机分为 3 组，每组 8 只，分别为空白                  构鉴定采用精确质量数匹配小于 25 ppm和二级谱图匹
          组、生甘遂组、醋甘遂组。空白组大鼠灌胃0.5%CMC-Na                       配的方式，检索实验室自建数据库以及BioCyc、HMDB、
          溶液，生甘遂组、醋甘遂组大鼠给予相应的供试品药液                            METLIN、HFMDB、LIPID  MAPS 等 数 据 库 。 应 用
         （850 mg/kg，2020年版《中国药典》中记载甘遂临床生药                     SIMCA-P 14.1软件进行模式识别（Umetrics、Umea、Swe‐
          最大用量的10倍剂量），给药体积均为10 mL/kg，连续给                      den 3种模式），数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维
                [7]
          药 20 d 。第 20 天收集大鼠 12 h 尿液，收集后立即离心                  统计分析，包括无监督的主成分分析（principle compo‐
         （12 000 r/min，4 ℃）10 min，分离上清液于－80 ℃冻存，              nents analysis，PCA）和有监督的正交偏最小二乘法-判


          · 424 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4                               中国药房  2023年第34卷第4期
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