Page 43 - 《中国药房》2023年4期

2.2.4 含量测定及纯度计算 分别精密量取1 mL供试 下色谱条件进样测定，记录色谱图，导入《中药色谱指纹
品溶液至25 mL容量瓶中，加5 mL 70%乙醇稀释，然后 图谱相似度评价系统（2012 版）》软件。设置 S4 样品图
加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min，加1 mL 谱为参照图谱，选择中位数法，时间窗口宽度为0.1 min，
10%硝酸铝溶液，摇匀，加10 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液， 通过多点校正和Mark峰匹配生成指纹图谱的叠加图谱
用 70% 乙醇定容至 25 mL，反应 15 min 后，在其最大吸 及对照指纹图谱（R），结果见图1；15批独一味总黄酮中
收 波 长 处 测 定 吸 光 度 ，并 代 入 公 式 ：纯 度（%）＝ 共确定了5个共有峰，其中3号峰为木犀草苷，详见图2。
测得的吸光度值´25´50 ×100% 3 4
10.674´称取的总黄酮样品质量(除水分)´1 000 2 400 1 2 5 R
2 200
2 000 S15
S14
计算各批次独一味总黄酮纯度。S1～S15批次独一味总 1 800 S13
1 600 S12
黄 酮 纯 度 分 别 为 ：87.26%、67.46%、72.44%、84.72%、 1 400 S11
S10
82.66%、76.89%、78.49%、70.49%、94.12%、71.38%、 U/mV 1 200 S9
S8
1 000
800 S7
S6
55.82%、74.63%、64.69%、93.68%、91.08%，平 均 值 为 600 S5
400 S4
77.72%，表明制备得到的总黄酮部位纯度较高，可用于 200 S3
S2
0 S1
独一味总黄酮的指纹图谱研究。
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
2.3 独一味总黄酮HPLC指纹图谱研究 t/min
图1 15批独一味总黄酮HPLC叠加图谱及对照指纹图
2.3.1 色谱条件 以 Waters Symmetry C18 （250 mm×
谱（R）
4.6 mm， 5 μm）为色谱柱；以乙腈（A）-0.2% 甲酸溶液
（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，8%A→13%A； 700
600 3
15～30 min，13%A；30～40 min，13%A→17%A；40～75 500 4
min，17%A→38%A；75～76 min，38%A→8%A；76～85 400 1
300
min，8%A）；流速为 1.0 mL/min；柱温为 35 ℃；检测波长 U/mV 200 2 5 独一味总黄酮样品（S4）
为245 nm；进样量为10 μL。记录75 min的色谱图。 100 木犀草苷
0 木犀草素
2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取木犀草苷、木 －100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
犀草素对照品各适量，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定 t/min
容，混匀，配制成 0.3 mg/mL 的对照品溶液，过 0.22 μm 3：木犀草苷
微孔滤膜，即得。 图2 独一味总黄酮样品和木犀草苷、木犀草素对照品
2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取独一味总黄酮样 的HPLC图
品 0.1 g，置于 25 mL 容量瓶中，加甲醇超声使溶解，定 由图 1 显示，3 号峰（木犀草苷）是独一味总黄酮中
容，混匀，过滤，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。 主要含有的成分，其苷元即为木犀草素。部分独一味总
2.3.4 精密度考察 精密称取样品（S1）0.1 g，按“2.3.3” 黄酮色谱图中虽出现了木犀草素的峰，但其峰面积较
项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续 小。有些批次如 S2、S9、S10 独一味总黄酮的色谱图中
进样测定6次。结果显示，以木犀草苷为参照峰，各共有 未出现木犀草素的峰，这可能是由于天然黄酮类化合物
峰相对保留时间 RSD 在 0.06%～0.19% 之间，相对峰面 多以苷类形式存在 ，且有研究表明，黄酮苷类化合物
[11]
积RSD在0.14%～3.84%之间，表明仪器精密度良好。 口服后常被肠道菌群产生的水解酶代谢以苷元的形式
2.3.5 稳定性考察 按照“2.3.3”项下方法制备供试品 吸收入血 。木犀草苷作为共有峰能为总黄酮质量控
[12]
溶液（S1），分别在制备后在室温放置0、4、8、12、18、24 h 制提供较大贡献。
时按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，以木犀 2.3.8 相似度评价 将 15 批独一味总黄酮色谱图导入
草苷为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD在0.07%～ 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，计
0.49% 之间，共有峰相对峰面积 RSD 在 0.05%～5.50% 算其与对照指纹图谱的相似度。结果显示，S1～S15 批
之间，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。 次独一味总黄酮与对照指纹图谱的相似度分别为
2.3.6 重复性考察 按照“2.3.3”项下方法平行制备6份 0.999、0.953、0.999、0.999、0.997、1.000、1.000、0.983、
供试品溶液（S1），按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结 0.925、0.992、0.995、0.991、0.996、0.996、0.976，表明 15 批
果显示，以木犀草苷为参照峰，各共有峰相对保留时间 独一味总黄酮的质量稳定，但仍然存在差异。
RSD在0.04%～0.22%之间，相对峰面积RSD在0.55%～ 2.4 独一味总黄酮的化学模式识别分析
3.52%之间，表明方法重复性良好。 2.4.1 聚类分析 以 5 个共有峰峰面积为变量，利用
2.3.7 指纹图谱的建立及样品分析 按照“2.3.3”项下 SPSS 20.0软件，先对原始数据进行标准化，再采用组间
方法制备15批独一味总黄酮供试品溶液，并按“2.3.1”项 平均数联结法进行聚类分析，结果见图 3。当判别距离

中国药房 2023年第34卷第4期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 4 · 421 ·