Page 48 - 《中国药房》2022年22期
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Disgenet（https：//www.disgenet.org/search）数据库并以相     DMN（2个穴位共给了3片）处理，每天1次，连续28 d。
          关性分数的中位值进行筛选，将筛选的靶点（即BA疾病                           2.2.3 各组大鼠一般症状观察及体质量测定 分别在
          靶点）输入UniProt数据库中获取标准化基因名。                           造模前1 d和造模后第7、14、21、28、35、42天记录各组大
          2.1.3 筛选 ST 与 BA 的共同靶点 将 ST 的靶点与 BA                 鼠咳嗽、打喷嚏、点头运动、抓耳挠腮、呼吸加快、毛发色
          的靶点分别导入 Venny 在线网站（https：//bioinfogp.cnb.           泽的情况，并测量体质量。
          csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图，取交集后，即         2.2.4 样本采集 末次给药后第 2 天，将大鼠麻醉后进
          为ST与BA的共同靶点。                                        行腹主动脉采血；血样静置1 h后，以3 000 r/min离心10
          2.1.4 构建 ST 与 BA 的蛋白相互作用网络 将 ST 和                   min，取上层血清，置于－80 ℃冰箱中保存备用。采血
          BA 的共同靶点导入 STRING 数据库（https：//cn.string-            完成后，将各组大鼠气管暴露，用一次性注射器将2 mL
          db.org/），设置物种为“homo sapiens”，置信度为“medium            磷酸盐缓冲液缓慢注入气管，用手轻轻按揉大鼠肺部，
          confidence≥0.4”，绘制蛋白相互作用（protein-protein in‐        待充分灌洗后回抽缓冲液，反复进行3次，即得支气管肺
          teraction，PPI）网络，然后利用 Cytoscape 3.9.0 软件根据          泡 灌 洗 液（bronchoalveolar  lavage  fluid，BALF）。 将
          degree值大小筛选关键靶点，从而确定ST抗BA的核心                        BALF以3 000 r/min离心10 min，取上清液，置于－80 ℃
          靶点。                                                 冰箱中保存备用。以上操作完成后，处死大鼠，取肺组
          2.1.5 ST与核心靶点的分子对接 将PPI网络中degree                    织，剪取右肺前叶，装入 EP 管中，置于－80 ℃冰箱中保
          值排名前3位的核心靶点导入PDB数据库（https：//www.                    存备用；取左肺，以4%多聚甲醛溶液固定备用。
          pdbus.org/），下载核心靶点“pdb”格式文件。在 TCMSP                 2.2.5 大鼠肺组织病理形态学观察 取“2.2.4”项下各
          数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中下载 ST 的      组大鼠固定于 4% 多聚甲醛溶液中的左肺组织，经乙醇
         “mol2”文件，然后采用 Pymol、AutoDock 软件将核心靶                  脱水、石蜡包埋、切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色，然
          点和 ST 进行去水、加氢等预处理，再通过 AutoDock 软                    后置于光学显微镜下观察肺组织病理形态学变化。
          件进行分子对接和结合能的计算。                                     2.2.6 大鼠血清、BALF和肺组织中PTGS2、MMP-9、IL-2
          2.2 ST-DMN抗BA的药效学实验                                 水平的测定 采用 ELISA 法进行测定。取“2.2.4”项下
              根据网络药理学方法及分子对接技术筛选的ST抗                          各组大鼠血清、BALF和肺组织，严格按照试剂盒说明书
          BA核心靶点进行药效学验证。                                      方法检测其中PTGS2、MMP-9、IL-2的水平。
          2.2.1 ST-DMN 的制备 根据本课题组前期实验方法                       2.3 统计学方法
                      [12]
          制备 ST-DMN 。将硫酸软骨素-聚乙烯吡咯烷酮 K30                           采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料采用
         （1∶1，m/m）作为针尖材料充分溶胀于 ST 水溶液（10                       x±s表示。各组间比较采用单因素方差分析；组间两两
          mg/mL）中，然后浇筑在微针模具凹槽表面，再以 4 000                      比较，方差齐时采用 LSD-t 检验，方差不齐时采用 Dun‐
          r/min离心10 min使其完全填充；刮去多余基质，于干燥                      nett’s T3检验。检验水准α＝0.05。
          器中干燥30 min，作为针尖层；将以ST水溶液充分溶胀                        3 结果
          的15%聚乙烯醇作为背衬材料，浇筑于上述已填充好针                           3.1 ST抗BA的作用靶点筛选结果
          尖层的模具中，以 4 000 r/min 离心 10 min 后，于干燥器               3.1.1 ST 靶点的筛选结果 本研究在 PharmMapper 数
          中干燥24 h，脱模，即得ST载药量为1 mg/片的ST-DMN。                   据库中得到 ST 靶点 231 个，在 Swiss Target Prediction 数
          同法制备不载药的空白微针。                                       据库中得到 ST 靶点 100 个，取并集后获得 258 个 ST
          2.2.2 分组、造模与给药 将30只大鼠随机分为空白对                        靶点。
          照组、模型对照组、空白微针组、白芥子散敷贴组（阳性                           3.1.2  BA 靶 点 的 筛 选 结 果  通 过 TTD、Genecard、
          对照组）、ST-DMN组，每组6只。各组大鼠适应性喂养1                        OMIM、Drug Bank、Disgenet 数据库对 BA 靶点进行筛
          周后，除空白对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组大                            选，删除重复项后共获取靶点677个。
          鼠分别于第1、8天腹腔注射10%卵清蛋白（含氢氧化铝                          3.1.3 ST 与 BA 共同靶点的筛选结果 将 ST 靶点与
          佐剂）1 mL 致敏，于第 15 天开始每天雾化吸入 1% 卵清                    BA 靶点共同导入 Venny 在线网站绘制韦恩图，得到交
          蛋白，每次 30 min，持续 4 周进行激发哮喘，以复制 BA                    集靶点70 个。
              [13]
          模型 。当大鼠出现咳嗽、呼吸急促、点头运动、抓耳挠                           3.1.4 ST 与 BA 的 PPI 网络构建结果 PPI 网络图（图
          腮等行为时，表明造模成功。各组大鼠于每次雾化后进                            1）显示，核心靶点排名前 10 位的蛋白分别为 PTGS2、
          行给药：空白对照组不处理；模型对照组于大鼠肺俞穴                            MMP-9、IL-2、EGFR（表皮生长因子受体）、HSP90AA1
          和大椎穴脱毛处理后涂抹生理盐水；空白微针组、白芥                           （热休克蛋白 90AA1）、ALB（白蛋白）、CCL5（趋化因子
          子散敷贴组、ST-DMN组大鼠于相同穴位分别给予空白                          配体5）、MAPK14（丝裂原活化蛋白激酶14）、MTOR（雷
                                       2
          微针、白芥子散（涂抹面积为1 cm ，给药量为1.5 g）、ST-                   帕霉素靶蛋白）、PGR（孕激素受体）。

          · 2730 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 22                            中国药房  2022年第33卷第22期
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