Page 24 - 《中国药房》2022年20期
P. 24

大学实验动物中心动物房（室内保持通风、干燥、洁净）                           物组细胞先用含相应药物或阻断剂的完全培养基培养
          内，并自由摄食、饮水。动物处置符合相关动物实验伦                            24 h 后，再用含 LPS 的完全培养基培养 24 h。LPS、
          理要求。                                                TLR4、秋水仙碱的质量浓度参考相关文献设置                 [11―12] 。
          2 方法                                                2.5 指标检测

          2.1 三叶香茶菜提取物的制备                                     2.5.1  纤维因子和炎症因子含量             收集各组细胞上清
              取适量三叶香茶菜饮片，加 10 倍量水浸泡 30 min，                   液，以2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清液，采用
          煮沸 60 min，用纱布过滤，收集滤液。同法重复提取 3                       ELISA 法以酶标仪于 570 nm 波长处检测肝星状细胞上
          次，合并滤液，加 95% 乙醇适量使乙醇最终体积分数为                         清液中α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的含量和肝细
          70%，搅拌，静置24 h后，过滤除渣，收集滤液，回收乙醇                       胞上清液中ALT、AST、IL-1β、IL-18的含量。
          并浓缩成浸膏（每 1 g 浸膏相当于生药 20 g），冷藏。将                     2.5.2  TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相关基因表达           采用
          浸膏用 DMEM 高糖培养基稀释，过滤除菌后用于细胞                          real-time PCR 法进行检测。收集各组细胞并提取其总
          实验。                                                 RNA。待测定浓度后，将总 RNA 逆转录成 cDNA，随后
          2.2 大鼠原代肝星状细胞、原代肝细胞的分离                              进行 PCR 扩增。PCR 反应体系包括：cDNA 模板 1 μL、
                        [9]
              参照张玉等 所建方法，依次通过肝逆向两步酶灌                          SYBR Premix Ex Taq（Ti RNaseH plus）7.5 μL、上/下游引
          注法原位消化，密度梯度离心分离，特征性表面抗原 α-                          物各 0.6 μL、ddH2O 5.3 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预
          SMA、结蛋白免疫荧光法鉴定，获得原代肝星状细胞。                           变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，
                    [10]
          参照叶娟等 所建方法，依次通过改良原位两步灌流法                            共循环 40 次。反应结束后，以 β-actin 作为内参，采用
          和多次过滤低速离心法分离，抗肝细胞角蛋白18免疫化                           2 －ΔΔCt 法计算目标基因 mRNA 的表达量，并以空白对照
          学法鉴定，获得原代肝细胞。所获细胞均接种于完全培                            组作为参照，计算各组目标基因 mRNA 的相对表达量。
          养基[含 10% 胎牛血清、青链霉素双抗的 DMEM 高糖培                      实验重复3次。所有引物均由生工生物工程（上海）股份
          养基，下同]中，在37 ℃、5%CO2条件下培养（下同）。                       有限公司设计、合成，引物序列及产物长度见表1。
          2.3  三叶香茶菜提取物对肝星状细胞及肝细胞增殖影                             表1    TLR4等目标基因的引物序列及产物长度
          响的检测                                                目标基因             引物序列（5′→3′）           产物长度/bp
                                                    4
              取原代肝星状细胞或肝细胞适量，按 6×10 个/mL                      TLR4        上游：GAGGCAGCAGGTCGAATTGT      86
                                                                          下游：AGAAGATGTGCCTCCCCAGA
          接种于96孔板中，分别用不同质量浓度的三叶香茶菜提                           IκBα        上游：AGACTCGTTCCTGCACTTGG      94
          取物[肝星状细胞：0.2、0.4、1、2、4 mg/mL，肝细胞：0.1、                           下游：GTTGAGGAAGGCCAGGTCTC
                                                              NF-κB p65   上游：TGAACTTGTGGGGAAGGACT      113
          0.5、1、1.5、2.5 mg/mL，均按生药量计（下同），质量浓度                             下游：GGTCTCGCTTCTTCACACACT
          参考前期预实验结果设置]干预，并设不含药物的空白                            NLRP3       上游：CCTGGATTTCTGCTAACGCC      131
                                                                          下游：TTCATCAGCACCTCTTGCGA
          对照组。培养 24 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 试剂
                                                              GSDMD       上游：CAGAACCAGTGTCTGGCAGT      76
          20 μL，继续培养4 h。使用酶标仪于570 nm波长处测定                                 下游：ATCTCCCAGGTCTGCTGAGT
                                                              ASC         上游：GAGGCCTTGAGGCAAACACA      71
          各孔的吸光度，计算增殖抑制率[增殖抑制率＝（空白对
                                                                          下游：TAGCTGGAAAAGATACCTCAGCTC
          照组吸光度－实验组吸光度）/空白对照组吸光度×                             β-actin     上游：CGTAAAGACCTCTATGCCAACA    136
          100%]和半数抑制浓度（IC50 ）。每质量浓度设3个复孔，                                 下游：TAGGAGCCAGGGCAGTAATC
          实验重复3次。                                             2.5.3  TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白表达           采用
          2.4 细胞分组与处理                                         Western blot 法进行检测。收集各组细胞，裂解后匀浆，
              将原代肝星状细胞或肝细胞传代培养至对数生                            以12 000 r/min离心5 min，取上清液。采用BCA法检测
          长期后，分为空白对照组、LPS 模型组、秋水仙碱（1                          蛋白浓度后，加 buffer 适量并于 100 ℃下变性 10 min。

          μmol/L）组、三叶香茶菜提取物（1 mg/mL，质量浓度参                     取变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
          考“2.3”项 下 IC50 设 置）组 、TLR4 阻 断 剂（TAK-242，           分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭
          1 μmol/L）组和 TLR4 阻断剂+三叶香茶菜提取物（1                     1 h，加入 TLR4、p-IκBα、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、
          μmol/L+1 mg/mL）组，每组设 3 个复孔。空白对照组细                   ASC、β-actin 一抗（稀释度均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育
          胞加入无LPS的完全培养基，培养24 h；LPS模型组细胞                       过夜；用TBST溶液清洗15 min×3次，加入相应二抗（稀
          加入含 LPS（100 ng/mL）的完全培养基，培养 24 h；各药                 释度为 1∶4 000），于 37 ℃下孵育 90 min。以 ECL 化学


          ·2450·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20                                 中国药房    2022年第33卷第20期
   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29