Page 19 - 《中国药房》2022年20期
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全部存活的幼鱼数×100%，死亡率（%）＝死亡胚胎数/总胚 沉积评价：将各孔斑马鱼用胚胎培养液清洗，再以4%多
胎数×100%。 聚甲醛固定过夜，依次用PBS和漂白液清洗3次；分别用
2.5 了哥王提取物对斑马鱼的急性毒性作用 85%、100%丙二醇脱水，用0.5%油红O染液染色3 h；染
[15]
参照文献方法 繁育斑马鱼，于实验前一天晚上， 色完成后，依次用100%、85%丙二醇脱色30 min，用PBS
将健康成年的斑马鱼按雌雄比例1∶1放入产卵缸中，使 清洗后于显微镜下观察油红O染液的染色情况，以评价
其自然受精。取受精卵，经清洗消毒后放入生化培养箱 斑马鱼的肝脏脂质沉积情况。
中孵育 96 h。随机选取 96 hpf、发育正常且无畸形的斑 2.6.5 斑马鱼 ALT、AST、LDH 活性的测定 按“2.6.1”
马鱼，转移至12孔细胞培养板中（每孔20尾斑马鱼），并 项下方法暴露处理后，吸去药液，每组选取10尾幼鱼进
加入适量的胚胎培养液培养 24 h，培养温度为（28.0± 行ALT、AST、LDH活性测定：将各孔斑马鱼用生理盐水
0.5）℃。 清洗，以滤纸吸干水分后称定质量；加入9倍量的生理盐
2.5.1 药物暴露质量浓度的选取与药液的配制 根据 水，于冰浴中充分研磨，所得匀浆产物于4 ℃下以3 500
课题组前期预实验结果，设置 10、20、27、37、51、72、90、 r/min 离心 10 min，取上清液，采用酶联免疫吸附测定法
检测各组上清液中ALT、AST、LDH活性。
100 μg/mL药物暴露浓度组，并按照“2.3”项下方法配制
2.7 统计学方法
质量浓度分别为 10、20、27、37、51、72、90、100 μg/mL 的
应用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资
了哥王提取物药液。
料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
2.5.2 暴露处理 慢慢吸出各孔中的胚胎培养液，分别
两两比较采用 LSD-t 检验（方差齐）或非参数秩和检验
加入“2.5.1”项下不同质量浓度的了哥王提取物药液进
（方差不齐）。检验水准α＝0.05。
行暴露，其余操作同“2.4.2”项下。
3 结果
2.5.3 半数致死浓度的计算 当暴露24、48、72 h时，统
3.1 了哥王提取物对斑马鱼胚胎发育影响的测定结果
计各个药物暴露浓度组死亡的斑马鱼数量，按“2.4.3”项
当斑马鱼的运动神经未发育完全时，会不受控制地
下方法计算死亡率，并运用 SPSS 26.0 软件绘制其急性
发生胚胎自主抽动；随着运动神经的逐渐发育，这种自
毒性线性回归方程并计算半数致死浓度（LC50 ）。
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主抽动的次数将会减少 。与空白组比较，各药物组斑
2.6 了哥王提取物对斑马鱼肝脏的毒性作用
马鱼胚胎的自主抽动次数均显著增加，了哥王提取物
2.6.1 药物暴露质量浓度的选取和暴露处理 根据
40 μg/mL组斑马鱼胚胎的心率显著降低（P＜0.05）。结
“2.5”项下急性毒性实验结果，设置药物低、中、高质量浓
果见表1。
度组，并设置含等体积胚胎培养液的空白组作为对照
表1 不同质量浓度了哥王提取物对斑马鱼胚胎自主抽
（每组设置 2 个复孔）。随机选取 96 hpf、发育正常且无
动次数、胚胎心率、畸形率、死亡率影响的测定结
畸形的斑马鱼，转移至12孔细胞培养板中（每孔20尾斑
果（x±s，n＝10）
马鱼）。经培养后，各药物组分别按4 mL/孔加入不同质
组别 1 min内自主抽动/次 暴露48 h后10 s内胚胎心率/次 畸形率/% 死亡率/%
量浓度的了哥王提取物药液，空白组加入等体积的胚胎 空白组 4.28±0.38 21.60±0.87 0 0
培养液和等量的DMSO，置于（28.0±0.5）℃恒温生化培 了哥王提取物10 μg/mL组 5.37±0.32 a 20.80±0.44 0 7.66±2.51 a
了哥王提取物20 μg/mL组 8.28±0.45 a 20.60±0.54 31.25±6.25 28.33±2.88 a
a
养箱中培养24 h。
a
了哥王提取物40 μg/mL组 8.78±0.15 a 19.20±0.92 a 99.00±1.00 76.66±2.88 a
2.6.2 斑马鱼肝脏表型的观察 按“2.6.1”项下方法暴
a：与空白组比较，P＜0.05
露处理后，吸去药液，每组选取10尾幼鱼进行表型观察：
空白组斑马鱼胚胎发育正常，未见发育畸形和死
将斑马鱼用胚胎培养液清洗3次，以侧躺姿态固定于涂
亡。与空白组比较，了哥王提取物 10 μg/mL 组斑马鱼
布有 3% 甲基纤维素凝胶的载玻片上，在体视荧光显微
的胚胎形态相似且无明显变化，了哥王提取物 20、40
镜下依次观察各组斑马鱼的肝脏表型变化并拍照记录。 μg/mL 组斑马鱼胚胎可见畸形（表现为心包肿大、卵黄
2.6.3 斑马鱼肝脏细胞凋亡的评价 按“2.6.1”项下方 囊畸形、体长变短等）；各药物组斑马鱼胚胎畸形率（了
法暴露处理后，吸去药液，每组选取10尾幼鱼进行细胞 哥王提取物 10 μg/mL 组除外）和死亡率均显著升高
凋亡评价：将各孔斑马鱼用胚胎培养液清洗后，于避光 （P＜0.05）。结果见表1。
条件下按2 mL/孔加入2.5 μg/mL吖啶橙染色液（以胚胎 3.2 了哥王提取物对斑马鱼急性毒性作用的测定结果
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培养液配制 ）进行染色；染色完成后，将斑马鱼用 PBS 空白组斑马鱼发育正常，72 h 内无死亡；药物暴露
反复清洗，以侧躺姿态固定于涂布有 3% 甲基纤维素凝 24、48、72 h 后，LC50分别为 39.850、28.300、21.490 μg/mL。
胶的载玻片上，在体视荧光显微镜下观察斑马鱼肝脏细 24、48、72 h的线性回归方程（式中，y为死亡率，x为药物
胞的凋亡情况，并拍照记录。 质量浓度）和 LC50见表 2。根据 LC50检测结果，本文以
2.6.4 斑马鱼肝脏脂质沉积的评价 按“2.6.1”项下方 27、37、51 μg/mL 作为了哥王提取物低、中、高质量浓度
法暴露处理后，吸去药液，每组选取10尾幼鱼进行脂质 进行后续实验。
中国药房 2022年第33卷第20期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20 ·2445·
