Page 56 - 《中国药房》2022年18期
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和伦理原则，符合国家实验动物福利伦理的相关规定，                            2.5 滑膜组织病理学观察
          审查证书编号为DW20191008-50。                                   采用 HE 染色法进行检测。取“2.2”项下 10% 多聚
          2 方法                                                甲醛溶液固定好的滑膜组织，依次用 50%、70%、80%、
          2.1 分组与造模                                           95% 乙醇以及无水乙醇脱水，二甲苯透明后浸蜡数小
              本实验造模方法参考文献[10]，取健康的新西兰兔                        时，常规石蜡包埋，切片，经HE染色后，用倒置显微镜对
          35只，适应性喂养3 d，随机分成空白组、模型组、阳性组                        滑膜组织病理情况进行观察并拍照。
                                                              2.6  滑膜组织中 TLR4、MyD88、NF-ккB p65 mRNA 相
         （双氯芬酸二乙胺乳胶剂 200 mg/kg）、SYF 高剂量组
                                                              对表达水平的检测
         （386 mg/kg）、SYF 低剂量组（97 mg/kg），各组 7 只（均为
                                                                  采用Q-PCR法进行检测。随机称取“2.2”项下各组
          雄性 4 只、雌性 3 只），阳性组给药剂量参考临床使用剂
                                                              中 3 只兔的滑膜组织 0.02 g，加入 RNA 裂解液 300 μL，
          量，SYF 高剂量组、SYF 低剂量组给药剂量参考预实验
                                                              在冰浴环境中充分匀浆裂解，所得裂解液按总 RNA 提
          结果。实验前先将兔的右后肢膝关节部位毛发剔除。
                                                              取试剂盒说明书中操作方法进一步提取 RNA；测定
          实验第1天，将兔仰卧位固定于兔台上，右后肢膝关节微
                                                              RNA浓度后，反转录为cDNA，质量浓度为10 ng/μL，按
          屈，露出皮肤并进行消毒，用1 mL注射器由髌骨外侧下
                                                              PowerUP SYBR Green Master Mix 试剂盒说明书中操作
          方斜上刺入关节腔，以进针顺畅、出现落空感、推液无阻                           方法制备反应体系，每组均设 3 个复孔，在 Q-PCR 仪中
          力为要点，注射木瓜蛋白酶混合液（含2%木瓜蛋白酶与                           进行反应。反应条件为：50 ℃尿嘧啶-DNA糖基化酶激
          0.03 mol/L L-半胱氨酸）0.5 mL，空白组兔注射等体积生                 活 2 min；95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火
          理盐水，注射完后伸屈膝关节20次，以便木瓜蛋白酶混                           15 s，72 ℃延伸 1 min，40 个循环。Q-PCR 结果以 2        －ΔΔCt
          合液更均匀分布于关节腔内，并于第 4、7 天重复注射。                         法计算各目标 mRNA 的相对表达水平。各基因引物信
          每天驱赶兔自由活动20 min，第14天后兔右后肢膝关节                        息见表1。
          出现肿胀，并有屈伸功能障碍，即KOA模型建立成功。                                      表1    TLR4等基因引物信息
          2.2  给药与取材                                          基因名称       正向引物（5＇→3＇）      反向引物（5＇→3＇）   产物长度/bp
              第 15 天开始，在各组兔的右后肢膝关节处涂抹给                        TLR4     GGGTGAAAGCGTCTATGATG  ATGATGTTGGCAGCGATG  162
                                                              MyD88    GAAGAAAGCGAGAAGCC  CGGTCAGACACGCACAG  221
          药，空白组用棉签擦拭生理盐水，模型组用棉签擦拭空
                                                              NF-кB p65  CCGCTGCCCTTCACCTA  TTCTTCCGCCGTTTGCT  137
          白基质白酒，阳性组按 200 mg/kg 给药剂量用棉签将双                      β-actin  GCCCCCCTGAACCCCAA  GCAGCGCGTAGCCCTCG  193
          氯芬酸二乙胺乳胶剂涂抹于兔右后肢膝关节处，SYF                            2.7  滑膜组织中 TLR4、MyD88、NF-ккB p65、p-NF-ккB
          高、低剂量组分别按 2.0 、0.5 mL/kg 给药剂量吸取 SYF                 p65蛋白相对表达水平的检测
          并均匀涂抹于兔右后肢膝关节处，再用棉签涂抹 1～2                               采用Western blot法进行检测。随机称取“2.2”项下
          min，促进药物吸收。每天给药 2 次，连续给药 20 d。实                     各组中 3 只兔的滑膜组织 0.02 g，加入含有蛋白酶抑制
          验过程中观察各组兔的精神状态、进食量、摄水量及右                            剂的组织裂解液0.5 mL，用玻璃匀浆器在冰水浴中充分
          后肢膝关节肿胀情况等变化。末次给药后第2天上午向                            匀浆裂解；裂解液用离心机在 4 ℃、12 000 r/min 条件下
          各组兔腹腔注射 20% 乌拉坦（注射量为 4.5 mL/kg）进                    离心10 min，上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋
          行麻醉，剪开右后肢膝关节，剪取部分滑膜组织，置                             白浓度；调整浓度后与蛋白上样缓冲液（5×）混匀，使蛋
          于－80 ℃冰箱低温保存，用于炎症因子水平、相关基因                          白终质量浓度为1 mg/mL，加热使蛋白变性。采用十二
                                                              烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔蛋白
          及蛋白的测定；另取部分滑膜组织用10%多聚甲醛溶液
                                                              上样体积为 20 μL，浓缩胶电压为 80 V，分离胶电压为
          固定，制作苏木精-伊红（HE）染色切片。
                                                              110 V；电泳结束后湿转法转膜，转膜电压为100 V，持续
          2.3 兔右后肢膝关节肿胀情况及关节腔病理观察
                                                              1 h；转膜结束后取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluo‐
              分别在实验第 0、8、14、35 天，用游标卡尺测量兔左
                                                              ride，PVDF）膜用封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲
          右后肢膝关节直径，计算右后肢膝关节肿胀度：肿胀度
                                                              液）室温封闭 2 h，TBST 缓冲液清洗 3 次，每次 5 min。
         （cm）＝右后肢膝关节直径－左后肢膝关节直径。实验
                                                              将 PVDF 膜分别加入 GAPDH、TLR4、MyD88、NF-кB
          结束后，肉眼观察右后肢膝关节腔的关节液、脂肪垫、关
                                                              p65、p-NF-кB p65一抗（稀释比例分别为1∶20 000、1∶1 000、
          节软骨、滑膜等组织的病理损伤情况。                                   1∶1 000、1∶3 000、1∶1 000），4 ℃孵育过夜；取出 PVDF
          2.4 滑膜组织中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的检测                      膜用TBST缓冲液洗涤3次后，加入相应二抗（稀释比例
              采用 ELISA 法进行检测。称取“2.2”项下滑膜组织                    为 1∶6 000），室温孵育 1 h 后，取出 PVDF 膜用 TBST 缓
          0.2 g，用剪刀剪碎，加入生理盐水1.8 mL，用玻璃匀浆器                     冲液洗涤3次。加入超敏化学发光试剂，用多功能分子
          在冰水浴中低温匀浆，将制备好的匀浆液以3 000 r/min                      成像仪扫描成像，利用Image J v1.8.0软件对图片条带进
          离心10 min，收集上清液。严格按照ELISA试剂盒说明                       行灰度分析，以目的蛋白与内参蛋白 GAPDH 灰度值之
          书测定IL-1β、TNF-α、PGE2水平。                              比作为蛋白的相对表达水平。实验重复3次。


          ·2226·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 18                                 中国药房    2022年第33卷第18期
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