Page 55 - 《中国药房》2022年18期

relative expression levels of TLR4，MyD88，NF-кB p65 mRNAs and TLR4，MyD88，p-NF-кB p65 proteins were significantly
increased （P＜0.05）. Compared with model group，swelling degree of right hind knee and the pathological injury degree of
synovial tissue were significantly improved in each treatment group，while the levels of IL-1β，TNF-α and PGE2 in synovial tissue
were significantly decreased（P＜0.05）. The relative mRNA expressions of TLR4，MyD88 and NF-кB p65 and relative protein
expressions of TLR4，MyD88 （except for SYF low-dose group）and p-NF- кB p65 were all significantly decreased （P＜0.05）.
CONCLUSIONS SYF shows protective effect on KOA induced by papain，the mechanism of which is associated with decreasing
the levels of IL-1β，TNF-α and PGE2 and down-regulating TLR4/MyD88/NF-кB signaling pathway.
KEYWORDS Shiyifang medicinal wine；knee osteoarthritis；inflammatory factor；TLR4/MyD88/NF-кB signaling pathway

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）亦称膝关节 1.2 主要药品与试剂
退行性骨关节病，可引起关节疼痛、僵硬、红肿、功能障 SFY（批号 20200302，生药量 193 mg/mL）由本课题
[9]
[1]
碍等 。随着我国人口老龄化，KOA 的发生率与日俱 组经正交实验法优选渗漉工艺制备 。木瓜蛋白酶（批
增，不仅给患者造成机体功能障碍及生理性疼痛，同时 号 1014k025）购于北京索莱宝科技有限公司；L-半胱
还导致其心理负担与经济压力。西医对于KOA的治疗 氨酸（批号 BCCC0025）购于美国 Sigma 公司；双氯芬
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[2]
以手术 和非甾体类抗炎药 为主。中医将 KOA 纳入 酸二乙胺乳胶剂[国药准字 H19990291，批号 4B5U，规
格 20 g∶0.2 g（以 C14H10Cl2NNaO2计）]购于北京诺华制药
“骨痹”“膝痹”范畴，辨证分析其病因为肝肾亏虚、气血
[4]
不足、筋骨失养、风寒湿邪乘虚内侵 。中药及其复方制 有限公司；白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤
坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素
剂在中医理论指导下，无论是外用还是内服，对KOA的
E2 （prostaglandin E2，PGE2 ）酶联免疫吸附测定（enzyme
治疗都有独特的优势。十一方药酒（以下简称“SYF”）
linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号均为
作为广西中医药大学第一附属医院特色院内制剂，由乳
202108）均购于江苏酶免实业有限公司；BCA 蛋白浓度
香、没药、红花、自然铜（锻）、续断、龙血竭、三七等中药
测定试剂盒、DNA上样缓冲液、超敏化学发光试剂盒（批
组成，具有舒筋活络、消肿散瘀、接骨止痛的功效，临床
号分别为 120320210705、121520210524、111919200716）
上对于软组织及骨关节炎相关疾病的治疗均表现出显
均购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗甘油醛-3-磷
著效果 [5―8] 。SYF的传统制备方法主要为冷浸法，此法对 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，
药材的提取时间及有效成分提取有一定的局限性。本 GAPDH）单 克 隆 抗 体 、辣 根 过 氧 化 物 酶（horseradish
课题组前期采用正交实验法优选渗漉工艺后制备获得 peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白 G（immu‐
SYF 。为进一步确定优化工艺制备的 SYF 治疗 KOA noglobulin G，IgG）二抗、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗
[9]
的作用，本实验以木瓜蛋白酶诱导的KOA兔为模型，观 （批号分别为 10013030、20000216、20000217）均购于美
察SYF对其保护作用，并揭示SYF作用机制与Toll样受 国Proteintech公司；兔抗TLR4多克隆抗体、兔抗MyD88
体 4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子 88（mye- 单克隆抗体、兔抗 NF-κB p65 单克隆抗体、兔抗磷酸化
loid differentiation factor 88，MyD88）/细 胞 核 因 子 NF- κB p65[anti-phospho NF- κB p65（S536），p-NF- κB
（nuclear factor кB，NF-кB）信号通路的相关性，旨在为 p65]单克隆抗体（批号分别为GR3407535-1、GR3356289-
SYF临床使用提供药理学依据。 13、GR325776-6、GR3381591-6）均购于英国Abcam公司；
1 材料 RNA 提取试剂盒（批号 0000484334）购于上海普洛麦格
生物产品有限公司；RevertAid第一链cDNA合成试剂盒
1.1 主要仪器
（批号 01127783）购于美国 Thermo Fisher Scientific 公
本研究所用主要仪器有SQP型分析天平[赛多利斯
司 ；PowerUP SYBR Green Master Mix 试 剂 盒（批 号
科学仪器（北京）有限公司]，TGL-20M 型高速低温离心
01090300）购于美国 Applied Biosystems 公司；β-actin、
机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），PH-030A型生
TLR4、MyD88、NF-κB p65 基因引物由上海捷瑞生物工
化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），Infinite M200pro
程有限公司设计、合成；其余试剂均为分析纯或实验室
型连续波长酶标仪（瑞士Tecan公司），DMIRB型倒置显
常用规格，水为纯化水。
微镜（德国 Leica 公司），Shandon Histocentre 3 型组织包
1.3 动物
埋机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），PowerPac 型 本实验所用动物为 CV 级新西兰兔，体质量 2.0～
通用电泳仪（美国 Bio-Rad 公司），UVP Chem Studio 815 2.5 kg，雌雄兼用，购自广西广得生物科技有限公司，动
型多功能分子成像仪（德国 Analytik Jena 公司），Light‐ 物生产许可证号为 SCXK（桂）2017-0001。动物购入后
Cycler96 型实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quan‐ 先在广西中医药大学动物实验中心 SPF 级动物房适应
titative polymerase chain reaction，Q-PCR）仪（美国Roche 性饲养 3 d，再进行正式实验。本动物实验方案经广西
公司）等。 中医药大学伦理委员会审核，符合动物保护、动物福利

中国药房 2022年第33卷第18期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 18 ·2225·