Page 44 - 《中国药房》2022年5期
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2.2 细胞增殖抑制率的检测                                      收集给药48 h后的细胞，加入300 μL RIPA裂解液，4 ℃
            采用 MTT 法检测。T47D 乳腺癌细胞消化传代后，                     冰上裂解 30 min，以 12 000 r/min 离心 20 min 取上清
        接种于96孔板中，使每个孔中细胞量为5×10 个，每孔体                        液。蛋白经定量、煮沸处理后，采用 12％十二烷基硫酸
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        积为100 μL。待细胞贴壁后加入不同剂量的莪术醇[终                         钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，加入对应的CDK2、
        质量浓度分别为 0（空白对照）、6.25、12.5、25、50、100、                Cyclin D、PCNA、CDK6、β-actin 抗体（稀释度分别为
        150 μg/mL，剂量参照文献[8]设定]，每个剂量设置3个复                    1 ∶ 2 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 8 000），4 ℃冰箱
        孔。于给药 24、48、72 h 后加入 20 μL 5 g/L 的 MTT 溶            过夜；次日用 PBST（PBS+吐温 20）洗膜 3 次，每次 10
        液，间隔4 h后加入150 μL二甲基亚砜，待甲瓒晶体溶解                       min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 或山羊
        后使用酶标仪在 490 nm 波长处检测吸光度（A）值，计                       抗兔 IgG 作为二抗（稀释度分别为 1 ∶ 4 000、1 ∶ 10 000），
        算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（％）＝（1－                           室温孵育 1 h；用 PBST（PBS+吐温 20）洗膜 3 次后，加入
        A 给药组/A 空白对照组 ）×100％。                               ECL显色剂，使用化学发光凝胶成像系统检测目的蛋白。
        2.3 细胞形态的观察                                         利用 Image J 软件分析，以目的蛋白与内参蛋白条带灰
            将对数生长期的 T47D 乳腺癌细胞接种于 6 孔板，                     度值的比值表示上述细胞周期相关蛋白的表达水平。
        加入不同剂量的莪术醇[终质量浓度分别为 0（空白对                           2.7 细胞中ROS的检测
        照）、12.5、25、50、100 μg/mL，剂量参照文献[9]设定]，每                  当T47D乳腺癌细胞培养皿中的细胞生长到融合度
        个剂量设置3个复孔。给药48 h后于倒置相差显微镜下                          为 80％～90％时，重悬并接种细胞至 6 孔板中，使每个
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        观察细胞形态并拍照。                                          孔中细胞量为4×10 个，待其贴壁后分为2组：其中一组
        2.4 细胞周期的检测                                         加入不同剂量莪术醇[终质量浓度同“2.3”项下，另依据
            采用流式细胞仪检测。将T47D乳腺癌细胞接种于                         MTT 结果添加半数抑制浓度（IC50 ）为 33 μg/mL 的剂量
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        70 mm培养皿中，调整细胞密度为5×10 个/皿，待细胞贴                      组]；另外一组加入33 μg/mL莪术醇干预6、12、24、48 h。
        壁后加入不同剂量的莪术醇（终质量浓度同“2.3”项下）。                        将两组细胞收集至15 mL离心管中，PBS洗涤3次后，用
        给药 48 h 后用 75％冰乙醇固定细胞，混匀后－20 ℃保                     500 μ L PBS 悬 浮 细 胞 ，每 个 样 品 加 入 ROS 探 针
        存；隔天离心弃上清液，以冰PBS洗涤2次，加入500 μL                       DCFH-DA，避光室温染色30 min；染色完毕，PBS洗涤3
        的 RNase A（100 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加入 25 μL         次，500 μL PBS 重悬细胞，300 目筛网过滤后上机检测
        PI避光室温染色30 min，300目筛网过滤，上机分析细胞                      ROS水平。根据结果确定最佳氧化时间为24 h、最佳给
        周期分布。利用Flow Jo软件分析G1、S、G2期细胞占比。                     药浓度为33 μg/mL。
        2.5  细胞周期相关基因mRNA表达水平的检测                                另取细胞分为空白对照组、NAC 组（单用 1 μmol/L
            采用qRT-PCR法检测。将T47D乳腺癌细胞接种于                      的 ROS 抗氧化剂 NAC）、莪术醇组（单用 33 μg/mL 的莪
        培养皿中，调整细胞密度为1×10 个/皿，待细胞贴壁后加                        术醇）、莪术醇联合 NAC 组（采用 1 μmol/L 的 ROS 抗氧
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        入不同剂量的莪术醇（终质量浓度同“2.3”项下）。给药                         化剂 NAC 预处理细胞 30 min，再加入 33 μg/mL 的莪术
        48 h 后收集细胞，依次加入 Trizol 试剂、三氯甲烷、异丙                   醇），给药 48 h 后于倒置相差显微镜下观察细胞形态并
        醇、乙醇提取总 RNA，检测 RNA 纯度及浓度后，按照试                       拍照，每个浓度设置 3 个复孔。采用流式细胞仪检测
        剂盒说明书进行qRT-PCR反应，PCR引物序列及产物长                        其 ROS 表达水平及周期分布。利用 Flow Jo 软件分析
        度见表1。采用Bio-Rad CFX Manager 3.0上机，以2          －ΔΔCt  G1、S、G2期细胞占比，DCFH-DA 探针检测 ROS 的荧光
        表示细胞周期相关基因的mRNA表达水平。                                强度（结果解析：平均荧光强度值越大，细胞中产生的
                  表1 PCR引物序列及产物长度                           ROS越多），同“2.6”项下方法检测ROS相关蛋白Nrf2和
         基因              引物序列                   产物长度/bp     Keap1（抗体稀释度分别为 1 ∶ 2 000、1 ∶ 4 000）的表达
         PCNA     上游：5′-GGCGTGAACCTCACCAGTAT-3′   126       水平。
                  下游：5′-CTTCGTGGTTTGGTCCTCTT-3′
         p21      上游：5′-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3′    139       2.8 统计学分析
                  下游：5′-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3′                采用 SPSS 21.0 统计软件分析数据。计量资料以
         CDK2     上游：5′-CTGCACTACGACCCTAACAAG-3′  143       x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
                  下游：5′-TGGAGGAGAGGGTGAGATTAG-3′
         β-actin  上游：5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′   219       两比较采用 LSD-t 检验；不同时间点的比较采用重复测
                  下游：5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′            量方差分析。采用 Graphpad Prism 8.0 作图工具作图。
        2.6  细胞周期相关蛋白表达水平的检测                                检验水准α＝0.05。
            采用 Western blot 法检测。将 T47D 乳腺癌细胞接               3 结果
        种于培养皿中，调整细胞密度为1×10 个/皿，待细胞贴壁                        3.1 莪术醇对T47D乳腺癌细胞增殖的影响
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        后加入不同剂量的莪术醇（终质量浓度同“2.3”项下）。                             莪术醇能使T47D乳腺癌细胞增殖抑制率显著升高


        ·550 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5                                    中国药房    2022年第33卷第5期
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