Page 80 - 《中国药房》2021年12期
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脱色时间9 h，上样质量浓度25 mg/mL。                             消化后，以 1 000 r/min 离心 5 min，吸弃上清液，加入完
        表3    管花肉苁蓉多糖大孔吸附树脂脱色的正交实验方                         全培养基调整细胞浓度，并按1×10 mL 接种至96孔板
                                                                                          5
                                                                                             －1
              差分析结果                                         中，每孔 100 μL，置于 37 ℃、5％CO2培养箱（下同）内培
        Tab 3 ANOVA for orthogonal experiment on decolo-    养。待细胞贴壁后，每孔吸弃上清液，按上述分组加入
               rization of macroporous adsorption resin deco-  完全培养基或含相应药液的完全培养基，继续培养24 h
               lorization of C. tubulosa polysaccharide     后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，室温孵育1 h后，用酶标

         方差来源       离差平方和   自由度    均方    F值   F临界值  显著性     仪在 450 nm 波长处检测各孔的吸光度（A）值并计算细
         A（洗脱流速）      66.07  2.00  33.03  24.51  19.00  有   胞增殖率：细胞增殖率（％）＝（实验组 A 值－空白组 A
         B（脱色时间）       7.00  2.00  3.50  2.60  19.00  无
         C（上样质量浓度）   130.63  2.00  65.31  48.46  19.00  有   值）/（对照组 A 值－空白组 A 值）×100％。采用 SPSS
         D（误差）         2.70  2.00  1.35                     25.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，
        2.2.4  验证实验      取质量浓度为25 mg/mL的管花肉苁                多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
        蓉多糖溶液3份，分别上样至填有大孔吸附树脂的层析                            LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。管花肉苁
        柱（100 cm×6 cm）中，分别吸附 9 h 后开始洗脱，洗脱流                  蓉多糖对RAW264.7细胞增殖率的影响见表4。
        速为1.2 BV/h，接流出液，浓缩后检测多糖脱色率、多糖                       表4   不同质量浓度的管花肉苁蓉多糖对RAW264.7细
        保留率并计算综合评分。结果，3 次重复试验综合评分                                胞增殖率的影响（x±±s，n＝5，％％）
        分 别 为 63.43％ 、63.29％ 、63.34％ ，平 均 值 为 63.35％        Tab 4 Effects of different concentrations of C. tubulo-
        （RSD＝0.11％，n＝3），表明此脱色方法可行。                                 sa polysaccharide on proliferation rate of
        2.3  管花肉苁蓉粗多糖的初步分离                                         RAW264.7 cells（x±±s，n＝5，％％）
        2.3.1 DEAE-650M 离 子 交 换 填 料 的 预 处 理         先 把      组别    6.25，μg/mL  12.5，μg/mL  25，μg/mL  50 ，μg/mL  100，μg/mL
        DEAE-650M离子交换填料倒入较大的容器内，加入3～                         CTC组  113.21±0.31 ＊  106.11±0.24  104.84±0.21  91.86±0.40 ＊  106.49±0.17
                                                             CTZ组  106.62±0.11  117.46±0.15 ＊  124.28±0.12 ＊  129.87±0.12 ＊  139.19±0.09 ＊
        4倍体积的水浸泡，等填料大部分沉底后弃去上清液，再
                                                             CT1组  85.84±0.45 ＊  82.60±0.39 ＊  94.55±0.35 ＊  85.57±0.38 ＊  72.76±0.49 ＊
        加入水重复以上操作3～5次，备用。                                    CT2组  124.84±0.23 ＊  137.90±0.20 ＊  139.85±0.17 ＊  107.41±0.32 ＊  133.19±0.15 ＊
        2.3.2  粗多糖分离       将层析柱（80 cm×4 cm）垂直固定              CT3组  92.85±0.24 ＊  76.07±0.50 ＊  86.17±0.34 ＊  84.00±0.49 ＊  68.93±0.53 ＊
                                                             CT4组  125.08±0.22 ＊  123.29±0.16 ＊  146.77±0.07 ＊  149.05±0.09 ＊  136.74±0.17 ＊
        在层析架上，装上经预处理的 DEAE-650M 离子交换填                        CT5组  105.37±0.21 ＊  130.67±0.15 ＊  123.90±0.11 ＊  104.54±0.25  116.09±0.19 ＊
        料，将已脱色的管花肉苁蓉多糖（记为 CTC）溶液 250                           注：与对照组[（100.00±0.12）％]比较，P＜0.05
                                                                                         ＊
        mL，以 25 mg/mL 的质量浓度上样至层析柱中，分别用                         Note：vs. control group[（100.00±0.12）％]， P＜0.05
                                                                                             ＊
        水和系列浓度的氯化钠溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）                 由表 4 可知，与对照组比较，6.25～100 μg/mL CTZ
        依次进行洗脱，收集洗脱液。其中，水洗脱下来的成分                           （6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5组和6.25 μg/mL CTC
        为中性多糖，不同浓度的氯化钠溶液洗脱得到的为酸性                            组细胞的增殖率均显著增加（P＜0.05），6.25～100
        多糖。将收集的洗脱液按洗脱曲线合并，经浓缩、透析                            μg/mL CT1、CT3组和50 μg/mL CTC组细胞的增殖率均
        后，冻干得到多个多糖组分。结果，分离出 1 种中性多                          显著降低（P＜0.05）。
        糖，记为 CTZ，含量为 229.2 mg/g；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5             按照毒性分级标准，细胞增殖率≥100％为 0 级，
        mol/L 氯化钠溶液洗脱的各酸性多糖分别命名为 CT-1、                      75％～99％为 1 级，50％～74％为 2 级，25％～49％为 3
        CT-2、CT-3、CT-4、CT-5，含量分别为 168.0、123.2、121.6、        级，1％～24％为4级，＜1％为5级，其中0和1级被认为
                                                                         [13]
        54.4、11.2 mg/g。                                     对细胞无毒性 。结果，当 CT1、CT3 质量浓度为 100
        2.4 管花肉苁蓉多糖对巨噬细胞免疫活性的影响                             μg/mL时，毒性可达到2级，因此选择12.5、25、50 μg/mL
        2.4.1  细胞增殖率的检测           采用 CCK-8 法进行检测。           作为后续研究的低、中、高质量浓度。
        实验分为空白组[只含完全培养基（含有 10％FBS、100                       2.4.2 NO 释放量的检测         采用 Griess 法进行检测。实
        U/mL 的链霉素和 100 U/mL 青霉素，下同）]、对照组（含                  验分为对照组（含细胞与完全培养基）、LPS组（含细胞、
        细胞与完全培养基）和不同质量浓度的CTC、CTZ、CT1、                       完全培养基和终质量浓度为 1 μg/mL 的 LPS）和低、中、
        CT2、CT3、CT4、CT5 组（含细胞、完全培养基和 6.25、                  高 质 量 浓 度 的 CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5
        12.5、25、50、100 μg/mL的管花肉苁蓉多糖、中性多糖和                  组[含细胞、完全培养基、终质量浓度为 1 μg/mL 的 LPS
        各酸性多糖，根据预实验结果设置质量浓度），每组设 5                          和低、中、高质量浓度（12.5、25、50 μg/mL）的管花肉苁蓉
        个复孔。取对数生长期的 RAW264.7 细胞，用胰蛋白酶                       多糖、中性多糖和各酸性多糖]，每组设 3 个复孔。取对


        ·1482 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12                                 中国药房    2021年第32卷第12期
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