Page 84 - 《中国药房》2021年12期
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β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）和 Tau 蛋白过度磷             试剂盒（批号 KGP250）、BCA 法蛋白定量检测试剂盒
        酸化造成的神经元大量死亡而导致的认知缺陷有关 。                           （批号 KGP902）、CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒（批号
                                                      [2]
        其中，Tau蛋白的过度磷酸化是由Aβ神经毒性引起的病                          KGA317）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Cal-
        理生理级联反应，而磷酸化的Tau蛋白同样影响着Aβ的                          bryte TM  520 AM 试剂盒（批号 21131）购自美国 AAT Bio-
        沉积，进一步协同产生神经毒性，形成恶性循环，最终导                           quest 公司；兔抗鼠、Fyn 多克隆抗体购自沈阳万类生物
        致神经系统衰竭、神经变性和认知能力下降                    [3－4] 。已有    科技有限公司；兔抗鼠磷酸化 Src（p-Src）多克隆抗体购
        研究证实，Aβ可通过激活非受体酪氨酸激酶Fyn并开放                          自 美 国 RD 公 司 ；兔 抗 鼠 A β 1-42 GluN2B、磷 酸 化
                                          2+
        谷氨酸受体2B（GluN2B）通道，引起Ca 大量内流，进一                     （p-GluN2B）、Tau、磷酸化Tau（p-Tau）多克隆抗体均购自
        步诱导 Tau 蛋白的过度磷酸化           [5－8] 。可见，Fyn/GluN2B     北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠β-肌动蛋白
        信号通路可通过调控Tau蛋白的磷酸化而影响AD的发                          （β-actin）多克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化
        生与发展。                                               物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗购自
            人参二醇（panaxadiol，PD）是从人参 Panax ginseng           武汉 ABclonal 公司；荧光素 Cy3 标记的驴抗兔 IgG 二抗
        C. A. Mey.中提取得到的一种三萜皂苷类单体化合物，                       购自美国 Jackson 公司；其余试剂均为分析纯或实验室
        是人参的三大苷元之一，在人参总皂苷水解物中的含量                            常用规格，水为去离子水。
                  [9]
        高达 8.75％ 。PD 具有多种药理作用，包括抗癌、抗缺                       1.3 细胞
        氧损伤、抗自由基等         [10－13] 。同时，PD对Aβ损伤的神经元               人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y、人源胚胎肾细胞
        具有保护作用       [14－15] 。APP基因是较早被发现的AD患者              293T（human emborynic kidney 293T，HEK 293T）均由首
        脑内的突变基因之一，表达APP基因的细胞系能够分泌                           都医科大学提供。
        高水平的Aβ，该细胞系已被广泛用于AD的研究 。本                           2 方法
                                                  [16]
        课题组前期成功构建了 APP 基因转染的人神经母细胞                          2.1  PD与Fyn蛋白的分子模拟对接
        瘤细胞 SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y 细胞）来模拟 Aβ沉积                     以“panaxadiol”为关键词，在中药系统药理学分析
        致AD发病的细胞模型，并发现PD对该细胞具有神经保                           平台数据库（TCMSP，https：//tcmspw.com）中检索得到
        护作用，但其保护机制尚不明确。鉴于此，本研究拟考                            PD 的二维结构，保存为“mol2”格式文件；以“Fyn”为关
        察 PD 对 APP-SH-SY5Y 细胞中 Tau 蛋白磷酸化及 Fyn/              键词，通过PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）检索并下
        GLuN2B信号通路的影响，以期为PD防治AD提供新的                         载Fyn的蛋白结构，保存为“mol2”格式文件。将两者的
        理论依据。                                              “mol2”格式文件分别导入AutoDockTools-1.5.6软件中，
        1 材料                                                调整X、Y、Z坐标轴并用Autodock vina 1.1.2软件进行模
        1.1  主要仪器                                           拟对接。对接完成后，用 Discovery Studio 2017 软件显
            Ti-S 型荧光显微镜购自日本 Nikon 公司；TGL-20M                示对接后的作用力，并以对接评分来评估结合亲和力。
        型台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器公司；                            若评分＜－4.0，则认为化合物与靶点蛋白具有较强的亲
        NU-4750E 型 CO2培养箱购自美国 Nuaire 公司；MR-96A              和力 。以 Fyn 抑制剂 PP2 为阳性对照，同法进行 PP2
                                                                [17]
        型酶标仪购自美国 Molecular Devices 公司；UV-5600 型             与Fyn蛋白的分子模拟对接。
        紫外-可见光分光光度计购自上海元析仪器有限公司；                            2.2  APP-SH-SY5Y细胞模型的构建
        Tanon-5200 型自动化学发光图像分析仪购自上海天能                           将GFP（或GFP-APP）质粒15 μg、pLP1质粒6.5 μg、
        科技有限公司。                                             pLP2 质粒 2.5 μg、pLP/VSV-G 质粒 3.5 μg 与 DMEM 高
        1.2 主要药品与试剂                                         糖培养基 250 μL 混合均匀，在室温下孵育 5 min。用脂
            PD 对照品（批号 19666-76-3，纯度 98.36％）购自成              质体-2000 介导转染 HEK 293T 包装细胞，分别于转染
        都普菲德生物技术有限公司；Fyn抑制剂PP2对照品（阳                         24、48、72 h 时收集上述 HEK 293T 细胞培养液的上清
        性对照，批号172889-27-99，纯度＞98％）购自美国Med-                  液。将上述上清液混合后，以3 000 r/min离心20 min去
        chem Express 公 司 ；DMEM 高 糖 培 养 基 、胎 牛 血 清           除细胞碎片，然后以 0.22 μm 滤膜过滤，滤液用 100 kDa
        （FBS）、胰蛋白酶消化液和青霉素/链霉素（P/S）双抗均                       超 滤 管 以 5 000 r/min 离 心 1 h，得 到 浓 缩 液 。 再 将
                                                                               6
        购自美国 Gibco 公司；绿色荧光蛋白（GFP）-APP 质粒、                   SH-SY5Y 细胞以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，待细胞生
        GFP质粒以及pLP1质粒、pLP2质粒、pLP/VSV-G质粒均                   长至密度为 70％时，弃去培养液；加入 0.5 mL 上述浓缩
        由本课题组前期自行构建；脂质体-2000转染试剂、聚凝                         液、0.5 mL 不完全培养基（不含 P/S 和 FBS 的 DMEM 高
        胺转染增强剂均购自美国 Invitrogen 公司；全蛋白提取                     糖培养基）和聚凝胺转染增强剂（10 μg/mL）适量后，置


        ·1486 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12                                 中国药房    2021年第32卷第12期
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