Page 85 - 《中国药房》2021年12期
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于37 ℃、5％CO2培养箱（下同）中常规培养12 h，然后换                    2.6 细胞中Fyn、GluN2B、Tau蛋白磷酸化水平的检测
        成完全培养基（含 P/S 和 FBS 的 DMEM 高糖培养基）继                      采用免疫细胞化学法进行检测。将 APP-SH-SY5Y
                                                                          4
        续培养；培养至第 3 天时，将培养基换为含有嘌呤霉素                         细胞分别以1×10 个/孔接种到96孔板中，按“2.5”项下方
       （4 μg/mL）的完全培养基继续培养，每 2 天换液 1 次，培                   法进行分组、处理24 h后，向各孔中分别加入4％多聚甲
        养1周后用于实验。                                          醛溶液 50 μL，在 4 ℃条件下固定 30 min。细胞用磷酸
        2.3 APP-SH-SY5Y细胞模型构建情况的验证                         盐缓冲液（PBS）洗涤3次，然后用0.1％Triton X-100试剂
            采用 Western blot 法进行检测。取第 2 代 APP-SH-           在室温下透化 5 min；再用 PBS 洗涤 3 次，然后分别加
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        SY5Y细胞和GFP-SH-SY5Y细胞，分别以1×10 个/孔接                  入相应一抗（Fyn 稀释比例为 1 ∶ 500，p-Src 稀释比例为
        种至6孔板中，分别作为APP组和GFP组（对照组）。常                        1 ∶ 800，GluN2B、p-GluN2B 稀释比例均为 1 ∶ 1 000，Tau、
        规培养12 h后，根据全蛋白提取试剂盒说明书方法提取                         p-Tau稀释比例均为1∶400）50 μL，4 ℃孵育过夜；吸弃培
        细胞中总蛋白，采用BCA法对蛋白进行定量后，在沸水                          养液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，再加入荧光素 Cy3 标记的
        浴中煮沸 5 min 进行变性。取变性后蛋白（20 μg）进行                    IgG二抗（稀释比例为1 ∶ 200，室温下孵育1 h；加入4′，6-
                                                           二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）试剂，室温避光孵育15 min，
        10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（恒压80 V，
        电泳时间 2.5 h），然后转移到聚偏二氟乙烯膜上（电压                       用 PBS 洗涤 3 次。使用荧光显微镜拍摄照片，然后用
                                                           Image J 1.51软件测定细胞的荧光强度，以磷酸化蛋白和
        80 V 转印 0.5 h）。用 5％脱脂奶粉封膜 1 h，加入 Aβ 1-42
                                                           总蛋白荧光强度的比值表示该蛋白的磷酸化水平。实
       （稀释比例为 1 ∶ 400）、β-actin（稀释比例为 1 ∶ 2 000）一
                                                           验重复3次。
        抗，4 ℃孵育过夜；TBST 缓冲液洗膜 5 min×4 次，加入
                                                           2.7  统计学方法
        HRP 标记的 IgG 二抗（稀释比例为 1 ∶ 800），室温孵育 1
                                                               使用 GraphPad Prism 5 软件对数据进行统计分析。
        h。ECL显色后，用全自动化学发光图像分析仪拍照，保
                                                           实验结果以x±s表示，两组间比较采用t检验；多组间比
        存。以β-actin为内参，采用Image J 1.51软件检测条带灰
                                                           较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验。
        度值，以目标蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值表示目
                                                           P＜0.05表示差异具有统计学意义。
        标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
                                                           3 结果
        2.4  PD和PP2给药浓度的考察
                                                           3.1  PD与Fyn蛋白的分子模拟对接结果
            采用 CCK-8 法检测细胞存活率，以确定 PD 和 PP2
                                                               分子对接结果显示，PD、PP2 与 Fyn 蛋白的氨基酸
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        的最佳给药浓度。将 APP-SH-SY5Y 细胞以 1×10 个/孔
                                                           残基均可以形成较强的氢键（PD 的对接评分＝－9.5；
        接种到96孔板中（含完全培养基，下同），然后将其分为
                                                           PP2 的对接评分＝－9.1），两者具有很好的空间及电性
        不同浓度的 PD（5、10、20、30、40 μmol/L，浓度依据前期
                                                           互补特征，易于形成稳定的结合构象。该结果表明，PD
        预实验结果设置）组（记为“APP+PD组”）和不同浓度的
                                                           与 Fyn 蛋白具有强相互作用，脱靶可能性较小，可为后
        Fyn抑制剂PP2（125、250、500、1 000、2 000 nmol/L，浓度
                                                           续实验验证提供理论依据。PD、PP2与Fyn蛋白的分子
        依据前期预实验结果设置）组（记为“APP+PP2 组”），每
                                                           对接2D图见图1。
        组均设置 3 个复孔；同时，另设加入 GFP-SH-SY5Y 细胞
                                                           3.2  APP-SH-SY5Y细胞模型的建立情况分析结果
        的对照组（记为“GFP 组”）和空白组。经相应培养基培
                                                               与GFP 组（0.21±0.11）比较，APP 组细胞中Aβ 1-42蛋
        养24 h后，向每孔中加入 CCK-8溶液10 μL，常规孵育2
                                                           白的表达水平（0.82±0.08）显著升高（P＜0.01），表明
        h。然后，使用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光                        APP-SH-SY5Y细胞模型构建成功。GFP组和APP组细
        度（A），并计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝（A 实验孔－                     胞的荧光显微图见图 2（图中，白光表示白光镜下图，荧
        A 空白孔 ）/（A 对照孔－A 空白孔 ）×100％。实验重复3次。                光表示GFP荧光图，合并表示两者的合并图），Aβ1-42蛋白
        2.5 细胞中Ca 浓度的检测                                    表达的电泳图见图3。
                     2+
            采 用 Calbryte TM  520 AM 探 针 法 进 行 检 测 。 将      3.3 PD和PP2给药浓度的筛选结果
                                    4
        APP-SH-SY5Y 细胞分别以 1×10 个/孔接种到 96 孔板                    与GFP组比较，APP组细胞的存活率显著降低（P＜
        中，然后将其分为 GFP 组、APP 组、APP+PD 组（PD 浓度                0.01）。与 APP 组比较，各给药组细胞的存活率均显著
        为 20 µmol/L）和 APP +PP2 组（PP2 浓度为 500 nmol/L），      升高（P＜0.05或P＜0.01）；且组间比较发现，当PD浓度
        每组设置 3 个复孔。分别处理 24 h 后，根据 Calbryte            TM   达到 20 µmol/L、PP2 浓度达到 500 nmol/L 时，再增加药
        520 AM 试剂盒说明书方法操作，使用荧光显微镜在                         物浓度后细胞的存活率均无显著变化（P＞0.05），因此
        610～640 nm波长范围内扫描各孔的荧光情况并检测其                       以20 µmol/L PD和500 nmol/L PP2进行后续实验。各组
                           2+
                                [18]
        荧光强度，以此反映Ca 浓度 。实验重复3次。                            细胞存活率的检测结果见表1。
        中国药房    2021年第32卷第12期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12  ·1487 ·
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