Page 79 - 《中国药房》2021年12期

学试剂有限公司；DEAE-650M离子交换填料（粒径40～ 2.2.2 洗脱方法 取经预处理的 AB-8 大孔吸附树脂
90 μm）购自日本 Tosoh 公司；AB-8 大孔吸附树脂（粒径 1.0 g，置于锥形瓶中，加入质量浓度为 8 mg/mL 的管花
3.3～1.25 mm）购自天津市光复精细化工研究所；胎牛 肉苁蓉多糖溶液 50 mL，摇床振摇 3 h，抽滤，接流出液，
血 清（FBS，批 号 1966173C）购 自 美 国 Gibco 公 司 ； 浓缩，烘干，备用。
DMEM高糖培养基（批号AF29562465）、链霉素+青霉素 2.2.3 实验参数优化 在参考文献[17－19]和前期单因
双抗（批号 AB10166019）、胰蛋白酶（批号 SH30042.01） 素实验的基础上，以多糖脱色率、多糖保留率为指标计
均购自美国 Hyclone 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，批号 算综合评分（根据前期研究结果设置权重均为50％），选
2035126，pH 7.4）购自以色列 BI 公司；NO 检测试剂盒 用L9 （3）正交实验设计对大孔吸附树脂脱色的洗脱流速
4
（Griess 法）（批号 011020200430）购自北京索莱宝科技 （A，BV/h）、脱色时间（B，h）、上样质量浓度（C，mg/mL）
有限公司；LPS购自美国Sigma公司；CCK-8细胞增殖毒 进行优化，确定管花肉苁蓉多糖的大孔吸附树脂脱色最
性测定试剂盒（批号 BJ05203090）购自北京博奥森生物 优工艺条件。管花肉苁蓉多糖大孔吸附树脂脱色的正
技术有限公司；IL-6（批号202012）、TNF-α（批号201922） 交实验因素与水平见表 1，实验设计与结果见表 2，方差
酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生 分析结果见表3。
物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。 表1 管花肉苁蓉多糖大孔吸附树脂脱色的正交实验因
1.3 细胞株 素与水平
小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命 Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment on
科学研究院细胞资源中心。 decolorization of macroporous adsorption re-
2 方法与结果 sin of C. tubulosa polysaccharide

2.1 相关指标的检测 水平 A（洗脱流速），BV/h B（脱色时间），h C（上样质量浓度），mg/mL
2.1.1 色素波长的选择及多糖脱色率的计算 管花肉 1 1.0 9 15
2 1.2 12 20
苁蓉多糖水提物经水适当稀释后，使用紫外-可见分光
3 1.5 15 25
光度计进行紫外-可见全波长扫描，结果未见最大吸收
表2 管花肉苁蓉多糖大孔吸附树脂脱色的正交实验设
波长。因溶液呈现的颜色是溶液吸收光的互补色，管花
计与结果
肉苁蓉多糖水提物脱色前后、稀释前后均为黄棕色，可
Tab 2 Orthogonal experimental design and results on
[13]
知溶液主要吸收蓝色波段的可见光 。因此，选择处于
decolorization of macroporous adsorption resin
该波段吸光度较大的450 nm作为检测波长，并按如下公
of C. tubulosa polysaccharide
式计算多糖脱色率：多糖脱色率（％）＝（A1－A2 ）/A1×
A（洗脱流 B（脱色 C（上样质量浓 D 多糖脱色 多糖保留 综合评
100％（式中，A1和A2分别为管花肉苁蓉多糖水提物经大 序号 速），BV/h 时间），h 度），mg/mL （空白） 率，％ 率，％ 分，％
孔吸附树脂处理前、后在450 nm波长处的吸光度）。 1 1. 1. 1. 1. 15.81 79.26 47.54
2.1.2 多糖质量浓度的测定及多糖保留率的计算 按 2 1. 2. 2. 2. 19.40 79.64 49.52
3 1. 3. 3. 3. 24.53 83.61 54.07
2020 年版《中国药典》（一部）中灵芝多糖含量测定项下
4 2. 1. 2. 3. 39.80 70.72 55.26
[14]
的硫酸-蒽酮法处理管花肉苁蓉中多糖 ：使用使用紫 5 2. 2. 3. 1. 37.46 85.18 61.32
6 2. 3. 1. 2. 25.97 78.77 52.37
外-可见分光光度计于625 nm波长处测定吸光度（A），并
7 3. 1. 3. 2. 35.41 90.60 63.01
根据回归方程 A＝39.603c－0.077 1（R ＝0.999 8）计算 8 3. 2. 1. 3. 20.40 83.25 51.83
2
管花肉苁蓉多糖的质量浓度 ，并按如下公式计算多糖 9 3. 3. 2. 1. 25.60 80.18 52.89
[15]
151.13 165.81 151.74 161.75
K1
保留率：多糖保留率（％）＝c2/c1×100％（式中，c1和 c2分
K2 168.95 162.67 157.67 164.90
别为管花肉苁蓉多糖水提物用大孔吸附树脂处理前、后 K3 167.73 159.33 178.40 161.16
管花肉苁蓉多糖的质量浓度）。该方法的方法学考察结 R 17.82 6.48 26.66 3.74
[16]
果均符合2020年版《中国药典》（四部）的相关规定 。 由表 2 的极差结果可知，各因素对综合评分的影响
2.2 吸附脱色实验 由高到低为C＞A＞B，说明上样质量浓度对大孔吸附树
2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 AB-8 大孔吸附树脂 脂脱色效果的影响最大，其次是洗脱流速和脱色时间。
（类型据前期研究结果选择）用95％乙醇浸泡24 h，倒去 由表3的方差分析结果可知，上样质量浓度和洗脱流速
浮在水面的小颗粒树脂后，用水清洗至澄清、无醇味，然 对大孔吸附树脂的脱色效果均有显著影响，脱色时间的
后分别用5％盐酸溶液和5％氢氧化钠溶液浸泡24 h，用 影响不显著。根据上述正交实验结果可知，大孔吸附树
水清洗至中性，最后用水浸泡并封存，备用。 脂脱色的最优参数组合为A2B1C3，即洗脱流速1.2 BV/h，

中国药房 2021年第32卷第12期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12 ·1481 ·