Page 81 - 《中国药房》2021年12期

数生长期的RAW264.7细胞，按“2.4.1”项下方法消化、重 长处检测各孔的A值，按ELISA试剂盒说明书方法计算
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悬后，按1×10 mL 接种至48孔板中，每孔300 μL，同法 IL-6、TNF-α释放量，并按“2.4.1”项下方法进行统计分
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培养。待细胞贴壁后，吸弃去上清液，按上述分组加入 析，结果见表5。
完全培养基或含相应药液的完全培养基，继续培养 48 h 由表 5 可知，与对照组比较，LPS 组细胞的 IL-6、
后，收集细胞上清液，以 1 000 r/min离心15 min，取上清 TNF-α释放量均显著升高（P＜0.05）。与LPS组比较，除
液，使用酶标仪在 540 nm 波长处检测各孔的 A 值，按 高质量浓度 CT1 组细胞的 IL-6 释放量显著升高（P＜
NO 检 测 试 剂 盒 说 明 书 方 法 计 算 NO 释 放 量 ，并 按 0.05）、中质量浓度 CT1 组细胞的 TNF-α和低质量浓度
“2.4.1”项下方法进行统计分析，结果见表 5。 CT5组细胞的IL-6释放量均无显著变化（P＞0.05）外，其
表 5 管花肉苁蓉多糖对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中 余 各 组 细 胞 的 IL-6、TNF-α 释 放 量 均 显 著 降 低（P＜
NO、IL-6、TNF-α释放量的影响（x±±s，n＝3） 0.05）。
Tab 5 Effects of C. tubulosa polysaccharide on the re- 3 讨论
lease of NO，IL-6 and TNF-α in RAW264.7 前期研究发现，水提管花肉苁蓉中多糖时会有较多
cells induced by LPS（x±±s，n＝3） 水溶性物质一同溶出，影响管花肉苁蓉多糖纯度，因此

组别 NO释放量，μmol/L IL-6释放量，pg/mL TNF-α释放量，pg/mL 进一步对其进行分离纯化，可为多糖物质基础及生物活
对照组 10.96±0.12 23.28±0.14 289.92±1.52 性研究奠定基础。大孔吸附树脂法是常用的脱色方
LPS组 17.72±0.27 ＊ 36.91±0.21 ＊ 432.96±2.47 ＊
低质量浓度CTC组 11.86±0.27 # 27.69±0.20 # 293.96±2.28 # 法 [17－19] 。由于目前还不清楚管花肉苁蓉中色素成分的
中质量浓度CTC组 12.72±0.20 # 28.88±0.15 # 288.88±2.24 # 极性，所以课题组前期通过静态吸附实验，从不同极性
高质量浓度CTC组 13.23±0.18 # 26.91±0.27 # 310.63±3.17 #
低质量浓度 CTZ组 14.95±0.25 # 27.37±0.24 # 293.00±2.30 # 的大孔吸附树脂中筛选了最适大孔吸附树脂 AB-8，该
中质量浓度 CTZ组 15.69±0.20 27.67±0.17 # 393.75±2.38 # 树脂对非目标成分具有较好的吸附能力，又对管花肉苁
高质量浓度CTZ组 17.65±0.15 29.61±0.23 # 318.13±2.58 # 蓉多糖具有较好保留能力。为达到更好的脱色效果，本
低质量浓度 CT1组 17.58±0.23 28.90±0.24 # 320.21±2.15 #
中质量浓度CT1组 18.83±0.16 23.62±0.35 # 426.13±1.97 研究在前期研究基础上，采用正交实验对脱色工艺（洗
高质量浓度CT1组 20.67±0.13 # 41.03±0.18 # 347.71±2.36 # 脱流速、脱色时间、上样质量浓度）进行了优化。结果，管
低质量浓度 CT2组 12.06±0.30 # 29.63±0.17 # 320.54±2.42 #
中质量浓度CT2组 12.68±0.19 # 23.49±0.42 # 367.88±2.26 # 花肉苁蓉多糖的最优脱色方法为洗脱流速1.2 BV/h，脱色
高质量浓度CT2组 14.24±0.12 # 24.24±0.37 # 394.29±1.56 # 时间9 h，上样质量浓度25 mg/mL。验证实验结果显示，
低质量浓度 CT3组 12.27±0.28 # 26.11±0.16 # 331.25±2.56 #
中质量浓度CT3组 12.92±0.21 # 28.18±0.19 # 345.29±3.41 # 本脱色方法可行。
高质量浓度CT3组 13.33±0.18 # 24.38±0.29 # 326.63±2.74 # 天然多糖的纯度及种类是影响其活性的重要因素，
低质量浓度CT4组 17.79±0.25 24.28±0.27 # 409.33±2.13 # 因此多糖分离纯化方法的相关研究仍然是天然活性多
中质量浓度CT4组 18.09±0.19 26.03±0.23 # 358.28±2.35 #
高质量浓度CT4组 19.01±0.16 # 26.94±0.26 # 342.63±2.49 # 糖研究工作的重点。多糖分离常用的方法有沉淀法、凝
低质量浓度CT5组 11.82±0.30 # 35.22±0.13 312.50±2.39 # 胶色谱法、阴离子交换色谱法、大孔树脂柱色谱法和超
中质量浓度CT5组 12.76±0.27 # 25.68±0.28 # 309.36±2.77 # [20]
高质量浓度CT5组 14.17±0.22 # 31.17±0.41 # 360.63±2.36 # 滤法等 。多糖因单糖组成不同，其所带电荷性质也会
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#
注：与对照组比较，P＜0.05；与LPS组比较，P＜0.05 有一定的差异，可被分为中性多糖和酸性多糖。中性多
Note：vs. control group， P＜0.05；vs. LPS group，P＜0.05 糖是由2种以上不含有机酸的不同糖基单体构成的聚合
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＊
由表 5 可知，与对照组比较，LPS 组细胞的 NO 释放 物；而酸性多糖在组成成分和结构上要比中性多糖复
量显著升高（P＜0.05）。与 LPS 组比较，低、中、高质量 杂，除含有 2 种以上的糖基单体外，还含有糖醛酸单
浓度 CTC、CTZ（中、高质量浓度除外）、CT2、CT3、CT5 体 。阴离子交换柱层析法是利用多糖所带电荷的差
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组细胞的 NO 释放量均显著降低（P＜0.05）；此外，高质 异将中性多糖与酸性多糖进行分离 。为此，本研究采
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量浓度 CT1、CT4 组细胞的 NO 释放量均显著升高（P＜ 用DEAE-650M离子交换柱层析柱对管花肉苁蓉多糖进
0.05）。 行分离，共分离出1种中性多糖、5种酸性多糖。
2.4.3 IL-6、TNF-α释放量的检测 按 ELISA 法进行检 巨噬细胞是免疫活性细胞，可通过吞噬和杀伤病原
测。取对数生长期 RAW264.7 细胞，按“2.4.1”项下方法 微生物，从而起到调节免疫的作用。已有研究表明，当
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消化、重悬后，按1×10 mL 接种至48孔板中，每孔500 人体受到病理或机械损伤刺激时，药物干预可激活巨噬
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μL，同法培养。待细胞贴壁后，吸弃上清液，按“2.4.2”项 细胞使 LPS 诱导的巨噬细胞吞噬能力增强，进而抑制
下方法进行分组、加药、培养，收集细胞上清液，以1 000 NO的产生和IL-6、TNF-α等系列炎症细胞因子的分泌，
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r/min离心15 min，收集上清液，使用酶标仪在450 nm波 从而保护宿主免受病原体的侵害 。为此，本研究检测

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