Page 81 - 《中国药房》2021年12期
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数生长期的RAW264.7细胞,按“2.4.1”项下方法消化、重                   长处检测各孔的A值,按ELISA试剂盒说明书方法计算
                       -1
        悬后,按1×10 mL 接种至48孔板中,每孔300 μL,同法                   IL-6、TNF-α释放量,并按“2.4.1”项下方法进行统计分
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        培养。待细胞贴壁后,吸弃去上清液,按上述分组加入                           析,结果见表5。
        完全培养基或含相应药液的完全培养基,继续培养 48 h                            由表 5 可知,与对照组比较,LPS 组细胞的 IL-6、
        后,收集细胞上清液,以 1 000 r/min离心15 min,取上清                TNF-α释放量均显著升高(P<0.05)。与LPS组比较,除
        液,使用酶标仪在 540 nm 波长处检测各孔的 A 值,按                     高质量浓度 CT1 组细胞的 IL-6 释放量显著升高(P<
        NO 检 测 试 剂 盒 说 明 书 方 法 计 算 NO 释 放 量 ,并 按           0.05)、中质量浓度 CT1 组细胞的 TNF-α和低质量浓度
       “2.4.1”项下方法进行统计分析,结果见表 5。                           CT5组细胞的IL-6释放量均无显著变化(P>0.05)外,其
        表 5  管花肉苁蓉多糖对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中                  余 各 组 细 胞 的 IL-6、TNF-α 释 放 量 均 显 著 降 低(P<
             NO、IL-6、TNF-α释放量的影响(x±±s,n=3)                 0.05)。
        Tab 5 Effects of C. tubulosa polysaccharide on the re-  3 讨论
               lease of NO,IL-6 and TNF-α in RAW264.7          前期研究发现,水提管花肉苁蓉中多糖时会有较多
               cells induced by LPS(x±±s,n=3)              水溶性物质一同溶出,影响管花肉苁蓉多糖纯度,因此

         组别         NO释放量,μmol/L  IL-6释放量,pg/mL  TNF-α释放量,pg/mL  进一步对其进行分离纯化,可为多糖物质基础及生物活
         对照组          10.96±0.12   23.28±0.14  289.92±1.52  性研究奠定基础。大孔吸附树脂法是常用的脱色方
         LPS组         17.72±0.27 *  36.91±0.21 *  432.96±2.47 *
         低质量浓度CTC组    11.86±0.27 #  27.69±0.20 #  293.96±2.28 #  法 [17-19] 。由于目前还不清楚管花肉苁蓉中色素成分的
         中质量浓度CTC组    12.72±0.20 #  28.88±0.15 #  288.88±2.24 #  极性,所以课题组前期通过静态吸附实验,从不同极性
         高质量浓度CTC组    13.23±0.18 #  26.91±0.27 #  310.63±3.17 #
         低质量浓度 CTZ组   14.95±0.25 #  27.37±0.24 #  293.00±2.30 #  的大孔吸附树脂中筛选了最适大孔吸附树脂 AB-8,该
         中质量浓度 CTZ组   15.69±0.20   27.67±0.17 #  393.75±2.38 #  树脂对非目标成分具有较好的吸附能力,又对管花肉苁
         高质量浓度CTZ组    17.65±0.15   29.61±0.23 #  318.13±2.58 #  蓉多糖具有较好保留能力。为达到更好的脱色效果,本
         低质量浓度 CT1组   17.58±0.23   28.90±0.24 #  320.21±2.15 #
         中质量浓度CT1组    18.83±0.16   23.62±0.35 #  426.13±1.97  研究在前期研究基础上,采用正交实验对脱色工艺(洗
         高质量浓度CT1组    20.67±0.13 #  41.03±0.18 #  347.71±2.36 #  脱流速、脱色时间、上样质量浓度)进行了优化。结果,管
         低质量浓度 CT2组   12.06±0.30 #  29.63±0.17 #  320.54±2.42 #
         中质量浓度CT2组    12.68±0.19 #  23.49±0.42 #  367.88±2.26 #  花肉苁蓉多糖的最优脱色方法为洗脱流速1.2 BV/h,脱色
         高质量浓度CT2组    14.24±0.12 #  24.24±0.37 #  394.29±1.56 #  时间9 h,上样质量浓度25 mg/mL。验证实验结果显示,
         低质量浓度 CT3组   12.27±0.28 #  26.11±0.16 #  331.25±2.56 #
         中质量浓度CT3组    12.92±0.21 #  28.18±0.19 #  345.29±3.41 #  本脱色方法可行。
         高质量浓度CT3组    13.33±0.18 #  24.38±0.29 #  326.63±2.74 #  天然多糖的纯度及种类是影响其活性的重要因素,
         低质量浓度CT4组    17.79±0.25   24.28±0.27 #  409.33±2.13 #  因此多糖分离纯化方法的相关研究仍然是天然活性多
         中质量浓度CT4组    18.09±0.19   26.03±0.23 #  358.28±2.35 #
         高质量浓度CT4组    19.01±0.16 #  26.94±0.26 #  342.63±2.49 #  糖研究工作的重点。多糖分离常用的方法有沉淀法、凝
         低质量浓度CT5组    11.82±0.30 #  35.22±0.13  312.50±2.39 #  胶色谱法、阴离子交换色谱法、大孔树脂柱色谱法和超
         中质量浓度CT5组    12.76±0.27 #  25.68±0.28 #  309.36±2.77 #   [20]
         高质量浓度CT5组    14.17±0.22 #  31.17±0.41 #  360.63±2.36 #  滤法等 。多糖因单糖组成不同,其所带电荷性质也会
                        *
                                         #
           注:与对照组比较,P<0.05;与LPS组比较,P<0.05                  有一定的差异,可被分为中性多糖和酸性多糖。中性多
           Note:vs. control group, P<0.05;vs. LPS group,P<0.05  糖是由2种以上不含有机酸的不同糖基单体构成的聚合
                                             #
                           *
            由表 5 可知,与对照组比较,LPS 组细胞的 NO 释放                  物;而酸性多糖在组成成分和结构上要比中性多糖复
        量显著升高(P<0.05)。与 LPS 组比较,低、中、高质量                    杂,除含有 2 种以上的糖基单体外,还含有糖醛酸单
        浓度 CTC、CTZ(中、高质量浓度除外)、CT2、CT3、CT5                  体 。阴离子交换柱层析法是利用多糖所带电荷的差
                                                              [21]
        组细胞的 NO 释放量均显著降低(P<0.05);此外,高质                     异将中性多糖与酸性多糖进行分离 。为此,本研究采
                                                                                          [22]
        量浓度 CT1、CT4 组细胞的 NO 释放量均显著升高(P<                    用DEAE-650M离子交换柱层析柱对管花肉苁蓉多糖进
        0.05)。                                             行分离,共分离出1种中性多糖、5种酸性多糖。
        2.4.3 IL-6、TNF-α释放量的检测         按 ELISA 法进行检            巨噬细胞是免疫活性细胞,可通过吞噬和杀伤病原
        测。取对数生长期 RAW264.7 细胞,按“2.4.1”项下方法                  微生物,从而起到调节免疫的作用。已有研究表明,当
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        消化、重悬后,按1×10 mL 接种至48孔板中,每孔500                     人体受到病理或机械损伤刺激时,药物干预可激活巨噬
                           5
        μL,同法培养。待细胞贴壁后,吸弃上清液,按“2.4.2”项                     细胞使 LPS 诱导的巨噬细胞吞噬能力增强,进而抑制
        下方法进行分组、加药、培养,收集细胞上清液,以1 000                       NO的产生和IL-6、TNF-α等系列炎症细胞因子的分泌,
                                                                                        [23]
        r/min离心15 min,收集上清液,使用酶标仪在450 nm波                  从而保护宿主免受病原体的侵害 。为此,本研究检测

        中国药房    2021年第32卷第12期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12  ·1483 ·
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