Page 81 - 《中国药房》2021年12期
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数生长期的RAW264.7细胞,按“2.4.1”项下方法消化、重 长处检测各孔的A值,按ELISA试剂盒说明书方法计算
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悬后,按1×10 mL 接种至48孔板中,每孔300 μL,同法 IL-6、TNF-α释放量,并按“2.4.1”项下方法进行统计分
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培养。待细胞贴壁后,吸弃去上清液,按上述分组加入 析,结果见表5。
完全培养基或含相应药液的完全培养基,继续培养 48 h 由表 5 可知,与对照组比较,LPS 组细胞的 IL-6、
后,收集细胞上清液,以 1 000 r/min离心15 min,取上清 TNF-α释放量均显著升高(P<0.05)。与LPS组比较,除
液,使用酶标仪在 540 nm 波长处检测各孔的 A 值,按 高质量浓度 CT1 组细胞的 IL-6 释放量显著升高(P<
NO 检 测 试 剂 盒 说 明 书 方 法 计 算 NO 释 放 量 ,并 按 0.05)、中质量浓度 CT1 组细胞的 TNF-α和低质量浓度
“2.4.1”项下方法进行统计分析,结果见表 5。 CT5组细胞的IL-6释放量均无显著变化(P>0.05)外,其
表 5 管花肉苁蓉多糖对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中 余 各 组 细 胞 的 IL-6、TNF-α 释 放 量 均 显 著 降 低(P<
NO、IL-6、TNF-α释放量的影响(x±±s,n=3) 0.05)。
Tab 5 Effects of C. tubulosa polysaccharide on the re- 3 讨论
lease of NO,IL-6 and TNF-α in RAW264.7 前期研究发现,水提管花肉苁蓉中多糖时会有较多
cells induced by LPS(x±±s,n=3) 水溶性物质一同溶出,影响管花肉苁蓉多糖纯度,因此
组别 NO释放量,μmol/L IL-6释放量,pg/mL TNF-α释放量,pg/mL 进一步对其进行分离纯化,可为多糖物质基础及生物活
对照组 10.96±0.12 23.28±0.14 289.92±1.52 性研究奠定基础。大孔吸附树脂法是常用的脱色方
LPS组 17.72±0.27 * 36.91±0.21 * 432.96±2.47 *
低质量浓度CTC组 11.86±0.27 # 27.69±0.20 # 293.96±2.28 # 法 [17-19] 。由于目前还不清楚管花肉苁蓉中色素成分的
中质量浓度CTC组 12.72±0.20 # 28.88±0.15 # 288.88±2.24 # 极性,所以课题组前期通过静态吸附实验,从不同极性
高质量浓度CTC组 13.23±0.18 # 26.91±0.27 # 310.63±3.17 #
低质量浓度 CTZ组 14.95±0.25 # 27.37±0.24 # 293.00±2.30 # 的大孔吸附树脂中筛选了最适大孔吸附树脂 AB-8,该
中质量浓度 CTZ组 15.69±0.20 27.67±0.17 # 393.75±2.38 # 树脂对非目标成分具有较好的吸附能力,又对管花肉苁
高质量浓度CTZ组 17.65±0.15 29.61±0.23 # 318.13±2.58 # 蓉多糖具有较好保留能力。为达到更好的脱色效果,本
低质量浓度 CT1组 17.58±0.23 28.90±0.24 # 320.21±2.15 #
中质量浓度CT1组 18.83±0.16 23.62±0.35 # 426.13±1.97 研究在前期研究基础上,采用正交实验对脱色工艺(洗
高质量浓度CT1组 20.67±0.13 # 41.03±0.18 # 347.71±2.36 # 脱流速、脱色时间、上样质量浓度)进行了优化。结果,管
低质量浓度 CT2组 12.06±0.30 # 29.63±0.17 # 320.54±2.42 #
中质量浓度CT2组 12.68±0.19 # 23.49±0.42 # 367.88±2.26 # 花肉苁蓉多糖的最优脱色方法为洗脱流速1.2 BV/h,脱色
高质量浓度CT2组 14.24±0.12 # 24.24±0.37 # 394.29±1.56 # 时间9 h,上样质量浓度25 mg/mL。验证实验结果显示,
低质量浓度 CT3组 12.27±0.28 # 26.11±0.16 # 331.25±2.56 #
中质量浓度CT3组 12.92±0.21 # 28.18±0.19 # 345.29±3.41 # 本脱色方法可行。
高质量浓度CT3组 13.33±0.18 # 24.38±0.29 # 326.63±2.74 # 天然多糖的纯度及种类是影响其活性的重要因素,
低质量浓度CT4组 17.79±0.25 24.28±0.27 # 409.33±2.13 # 因此多糖分离纯化方法的相关研究仍然是天然活性多
中质量浓度CT4组 18.09±0.19 26.03±0.23 # 358.28±2.35 #
高质量浓度CT4组 19.01±0.16 # 26.94±0.26 # 342.63±2.49 # 糖研究工作的重点。多糖分离常用的方法有沉淀法、凝
低质量浓度CT5组 11.82±0.30 # 35.22±0.13 312.50±2.39 # 胶色谱法、阴离子交换色谱法、大孔树脂柱色谱法和超
中质量浓度CT5组 12.76±0.27 # 25.68±0.28 # 309.36±2.77 # [20]
高质量浓度CT5组 14.17±0.22 # 31.17±0.41 # 360.63±2.36 # 滤法等 。多糖因单糖组成不同,其所带电荷性质也会
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注:与对照组比较,P<0.05;与LPS组比较,P<0.05 有一定的差异,可被分为中性多糖和酸性多糖。中性多
Note:vs. control group, P<0.05;vs. LPS group,P<0.05 糖是由2种以上不含有机酸的不同糖基单体构成的聚合
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由表 5 可知,与对照组比较,LPS 组细胞的 NO 释放 物;而酸性多糖在组成成分和结构上要比中性多糖复
量显著升高(P<0.05)。与 LPS 组比较,低、中、高质量 杂,除含有 2 种以上的糖基单体外,还含有糖醛酸单
浓度 CTC、CTZ(中、高质量浓度除外)、CT2、CT3、CT5 体 。阴离子交换柱层析法是利用多糖所带电荷的差
[21]
组细胞的 NO 释放量均显著降低(P<0.05);此外,高质 异将中性多糖与酸性多糖进行分离 。为此,本研究采
[22]
量浓度 CT1、CT4 组细胞的 NO 释放量均显著升高(P< 用DEAE-650M离子交换柱层析柱对管花肉苁蓉多糖进
0.05)。 行分离,共分离出1种中性多糖、5种酸性多糖。
2.4.3 IL-6、TNF-α释放量的检测 按 ELISA 法进行检 巨噬细胞是免疫活性细胞,可通过吞噬和杀伤病原
测。取对数生长期 RAW264.7 细胞,按“2.4.1”项下方法 微生物,从而起到调节免疫的作用。已有研究表明,当
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消化、重悬后,按1×10 mL 接种至48孔板中,每孔500 人体受到病理或机械损伤刺激时,药物干预可激活巨噬
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μL,同法培养。待细胞贴壁后,吸弃上清液,按“2.4.2”项 细胞使 LPS 诱导的巨噬细胞吞噬能力增强,进而抑制
下方法进行分组、加药、培养,收集细胞上清液,以1 000 NO的产生和IL-6、TNF-α等系列炎症细胞因子的分泌,
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r/min离心15 min,收集上清液,使用酶标仪在450 nm波 从而保护宿主免受病原体的侵害 。为此,本研究检测
中国药房 2021年第32卷第12期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12 ·1483 ·