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decreased significantly in nucleus while was increased significantly in cytoplasm （P＜0.01）. After SFI treatment，the nuclear
translocation and secretion of HMGB1 were inhibited in different degrees；compared with LPS group，mRNA and protein
expression of HMGB1 in administration groups，protein expression of TLR4 in RAW264.7 cells of positive control group，SFI
medium- and high-dose groups as well as the levels of HMGB1，IL-1β and TNF-α in supernatant of cells in administration groups
were decreased significantly（P＜0.01）. In positive control group，SFI medium- and high-dose groups，the protein expressions of
HMGB1 in nucleus were increased significantly，while protein expressions of HMGB1 in cytoplasm were decreased significantly
（P＜0.01）. CONCLUSIONS：SFI may inhibit the nuclear translocation and secretion of HMGB1 in RAW264.7 cells，thus avoiding
the activation of inflammatory pathways and the production of inflammatory factors，so as to reduce the inflammatory response
induced by LPS.
KEYWORDS Shenfu injection；RAW264.7 cells；HMGB1；Inflammatory factors；Nuclear translocation

感染性休克的病程发展与免疫细胞过度激活有关， 20170324，规格：10 mL）；RGFP966 原料药[美国 Selleck
大量炎症因子的产生使得炎症反应从可控进展为不可 公 司 ，批 号 ：S7229，纯 度 ：≥98％ ，用 二 甲 基 亚 砜
[1]
控，最终导致患者多器官功能衰竭，甚至死亡 。高迁移 （DMSO）溶解至10 mmol/L，于4 ℃保存，备用]；LPS（美
率族蛋白 B1（High mobility group box 1，HMGB1）为感 国 Sigma 公司，批号：20170920，纯度：≥99％；来源于大
染性休克晚期的致死性炎症因子，在细菌脂多糖（LPS） 肠杆菌 055：B5，用水配制成质量浓度为 10 mg/mL 的工
等致炎因子的作用下，定位于细胞核内的 HMGB1 将向 作溶液，于 4 ℃保存，备用）；DMEM 高糖培养基（美国
胞浆迁移，最后分泌出胞，在胞外的HMGB1通过结合细 HyClone 公司，批号：AD16191267）；0.25％胰酶（批号：
胞膜上的晚期糖基化终产物受体（RAGE）和Toll样受体 0035017）、胎牛血清（FBS，批号：1741844）均购自以色列
4（TLR4）来启动炎症反应，共同激活核因子κB（NF-κB） Biological Industries公司；青霉素/链霉素双抗（北京索莱
及下游炎症因子级联反应，这可能是感染性休克高死亡 宝科技有限公司，批号：AD20170804）；BCA蛋白定量试
率的原因之一 [2-4] 。 剂 盒（ 美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司 ，批 号 ：
中医认为，感染性休克属“厥脱”范畴，运用源自《伤 SL260210）；核/浆蛋白分离试剂盒（江苏凯基生物技术
寒论》四逆加人参汤的参附注射液（SFI）治疗具有较好 股份有限公司，批号：20170605）；兔HMGB1单克隆抗体
的效果 [5-6] 。本课题组前期通过动物实验研究发现，SFI （美国 Epitomics 公司，批号：YH081809）；兔 TLR4 单克
可抑制内毒素休克模型大鼠肺组织中 HMGB1 的转录、 隆抗体（批号：ab13556）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的
表达和血浆中 HMGB1 的分泌水平，但其机制还有待深 山羊抗兔 IgG 二抗（批号：GR313248-1）、CCK-8 试剂盒
入研究 [7-8] 。在此基础上，本研究拟考察 SFI 对 LPS 诱导 （批号：ab228554）均购自英国 Abcam 公司；兔β-肌动蛋
的RAW264.7细胞中HMGB1蛋白核转位的影响及可能 白（β-actin）单克隆抗体（批号：AA128-1）、兔 H3 单克隆
机制，以期为SFI的临床应用提供实验依据。 抗体（批号：AF0009）、Cy3标记的山羊抗兔IgG二抗（批
1 材料 号：A0516）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（批
1.1 仪器 号：C1002）、Trizol 试剂（批号：101006）、苯甲磺酰氟
Form 321 型 CO2培养箱（美国 Thermo Fisher Scien- （PMSF）蛋白酶抑制剂（批号：410051）、磷酸盐缓冲液
tific 公司）；EnSpire 型多功能酶标仪（美国 PerkinElmer （PBS，pH 7.4，批号：ST476）、Triton X-100 试剂（批号：
公司）；DHP-9012 型恒温培养箱（上海一恒科技有限公 SY1020）、吐 温 20（批 号 ：ST825）、山 羊 血 清（批 号 ：
司）；PowerPac300型电泳仪、170-3930型转膜仪、CFX96 C0265）、RIPA裂解液（批号：P0013B）均购自碧云天生物
型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国 Bio-Rad 公 技术研究所；逆转录试剂盒（批号：M20100）、定量聚合
司）；GN98-ⅢD 超声波细胞裂解仪（上海谷宁仪器有限 酶链反应（qPCR）试剂盒（批号：M30510）均购自北京全
公司）；Tanon 5200型全自动化学发光图像分析仪（上海 式金生物科技有限公司；ECL 化学发光试剂盒（美国
天能科技有限公司）；Ama240型高压灭菌锅（英国Astell Millipore 公司，批号：1801501）；小鼠 HMGB1（批号：
公司）；LSM800型激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公 M173318-215a）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：M170318-
司）；SW-CJ-2D型超净工作台（苏州净化设备有限公司）； 102a）、白细胞介素1β（IL-1β，批号：M190325-318a）酶联
CKX41型普通光学倒置显微镜（日本Olympus公司）。 免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒均购自欣博盛生物
1.2 药品与试剂 科技有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有
参 附 注 射 液（雅 安 三 九 药 业 有 限 公 司 ，批 号 ： 限公司设计、合成（见表1）；其余试剂均为实验室常用规

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