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格，水为超纯灭菌水。                                         基0.5 mL，各给药组先加入等量LPS培养30 min后再加
                    表1 PCR引物序列及长度                          入含相应药物的完全培养基 0.5 mL，每组设 3 个复孔。
              Tab 1 PCR primer sequence and length         细胞培养24 h后，用4 ℃预冷的PBS清洗，置于4％多聚

        基因                 引物序列               引物长度，bp      甲醛溶液中室温固定 20 min；用 PBS 清洗 3 次，加入
        HMGB1      上游：5′-GTTCAAGGACCCCAATGCAC-3′  97       0.5％ TritonX-100试剂适量，室温反应20 min；用PBS清
                   下游：5′-TGGATAAGCCAGGATGCTCG-3′
        GAPDH      上游：5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′  108     洗 5 min×3 次，以 10％山羊血清封闭 1 h；加入 HMGB1
                   下游：5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3′           一抗（稀释度为1 ∶ 200），于4 ℃孵育过夜；用磷酸盐吐温
        1.3 细胞                                             缓冲溶液（PBST）清洗5 min×3次，加入Cy3标记的二抗
            小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株购自中国科学                      （稀释度为 1 ∶ 500），室温避光孵育 1 h；用 PBST 清洗 5

        院上海细胞库。                                            min×4 次（此步骤及后续所有步骤均需避光操作），以
        2 方法                                               DPAI 染料（1 mL 反应液中加入 DPAI 染液 1 μL）染核 5
        2.1 细胞培养                                           min；用 PBST 清洗 5 min×4 次，用含荧光淬灭剂的甘油
            将 RAW264.7 细胞置于含 10％FBS、青霉素/链霉素                封片后，置于激光共聚焦扫描显微镜下观察 HMGB1 的
        双抗（青霉素、链霉素浓度分别为100 U/mL、100 μg/mL）                 染色情况及其在细胞内的定位并拍照。
        的DMEM高糖培养基中（以下简称“培养基”），于37 ℃、                      2.3.2  细胞中 HMGB1 mRNA 表达情况检测              采用实
        5％CO2培养箱中培养（培养条件下同）。使用倒置显微                         时荧光PCR法检测。取对数生长期细胞，按1×10 个/孔
                                                                                                      5
        镜观察示细胞呈圆形且折光性好，部分细胞突起。取对                           接种于 6 孔板中，按“2.3.1”项下方法分组、给药（每孔总
        数生长期（融合度达70％～80％）的细胞进行后续试验。                        体积为 2 mL）。细胞培养 24 h 后，用 Trizol 试剂提取细
        2.2  给药剂量筛选                                        胞总RNA，采用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。以
            取RAW264.7细胞适量，经胰酶消化、计数后，按5×                    cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（共 20
          3
        10 个/孔接种于96孔板中，培养至对数生长期。将细胞                        μL）：cDNA 模板 1 μL、dNTP 0.2 μL、上/下游引物各 0.15
        随机分为对照组和药物组（SFI 最终剂量分别为 1、2、4、                     μL、Taq 酶 0.2 μL、PCR Buffer 2 μL、ddH2O 16.3 μL。反
                                                  [9]
        8、12、16、20 μL/mL，剂量设置参考前期研究方法 和预                   应条件：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30
        试验结果）。对照组加入培养基 100 μL，各药物组加入                       s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采
        含相应量 SFI 的培养基 100 μL，每组设 5 个复孔；同时，                 用2  －ΔΔCt 法 计算HMGB1 mRNA的表达量。
                                                                    [12]
        设置5个不含细胞、只含培养基100 μL的空白孔。细胞                        2.3.3  细胞中HMGB1、TLR4蛋白表达情况检测                采用
        培养24 h后，加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h后，使                  Western blotting 法检测。取对数生长期细胞，按“2.3.2”
        用酶标仪于 450 nm 波长处测量各孔光密度（OD）值，并                     项下方法分组、给药，培养 24 h 后，各组取部分细胞用
        计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝（检测孔OD值－空                         4 ℃预冷的PBS清洗2次，加入RIPA裂解液（含PMSF蛋
        白 孔 OD 值）/（对 照 组 孔 OD 值 － 空 白 孔 OD 值）×             白酶抑制剂）200 μL，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min
        100％。选择不影响细胞存活率的最高剂量作为后续试                          离心 15 min，取上清液，即得总蛋白。按核/浆蛋白试剂
        验的高剂量，并以其1/2、1/4分别作为中、低剂量。                         盒说明书方法提取蛋白：各组取另一部分细胞加预冷的
        2.3 SFI 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞炎症反应的干预                Buffer A 200 μL，涡旋剧烈振摇15 s，冰上放置15 min；加
        作用考察                                               预冷的 Buffer B 11 μL，涡旋剧烈振摇 5 s，冰上放置 1
        2.3.1  细胞中 HMGB1 定位观察          采用免疫荧光法检            min；于 4 ℃下以 12 500 r/min 离心 5 min 后，收集上清
        测。参照文献方法 制作细胞炎症模型，将灭菌盖玻片                           液，即得浆蛋白。在离心沉淀物（即细胞核）中加入预冷
                        [10]
        置于24孔板（每孔含培养基0.5 mL）中，取对数生长期细                      的Buffer C 100 μL，超声（功率：150 W，频率：25 kHz）裂
                 4
        胞，按2×10 个/孔滴加至各孔盖玻片上，培养24 h后，将                     解2 min，冰上放置40 min，其间每隔10 min涡旋15 s；于
        细胞随机分为空白对照组、LPS 组、阳性对照组（RG-                        4 ℃下以 12 500 r/min 离心 10 min，收集上清液，即得核

                                 [11]
        FP966，最终浓度为10 μmol/L ）和SFI低、中、高剂量组                 蛋白。采用BCA法检测总蛋白浓度后，沸水煮5 min使
       （剂量设置参考“2.2”项下结果），空白对照组加入含双                         蛋白变性。取变性蛋白适量，经 SDS-PAGE 分离后，转
        抗、不含血清的 DMEM 高糖培养基（以下简称“完全培                        移至 PVDF 膜上，以脱脂牛奶室温封闭 2 h，再分别加入
        养基”）0.5 mL，LPS组加入含0.2 μg/mL LPS的完全培养               HMGB1、TLR4、β-actin、H3一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），


        中国药房    2020年第31卷第21期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 21  ·2587 ·
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