Page 29 - 2020年19期
P. 29

死因子α（TNF-α）试剂盒（批号：2018011）、白细胞介素                   2.4 分子对接
        1β（IL-1β）试剂盒（批号：2011104）、IL-6 试剂盒（批号：                  筛选“2.3”项下的关键靶点与“2.1”项下的沙棘活性
        2018031）、IL-10 试剂盒（批号：2017125）均购自碧云天               成分，导入 SYBYL-X 2.1 软件（https：//en.freedownload-
        生物科技公司。                                            manager.org/Windows-PC/SYBYL-X.html）中进行分析、
            沙棘购于佳木斯民生药行（批号：180312），经佳木                     预测，评价沙棘活性成分与关键靶点之间的结合活性，
        斯大学药学院张宇教授鉴定为胡颓子科植物沙棘 H.                           并以分值来评价其结合活性：分值＞4.25表示两者有一
        rhamnoides L.的干燥果实，经石油醚回流提取，经高温                    定的结合活性，分值＞5.0 表明有较强的结合活性，分
                                                                                        [18]
        水化法脱胶、高温淡碱法脱酸、活性白土脱色精制后，得                          值＞7.0表明具有很强的结合活性 。
        沙棘果油提取物。沙棘用71％乙醇提取，得沙棘多酚提                          2.5 GO分析与KEGG通路富集分析
        取物（多酚含量：56.25％）。以上提取物由佳木斯大学药                           将“2.2”项下沙棘治疗 AD 的潜在靶点导入 Cyto-
        学院药物化学实验室提供并测定。                                    scape 3.7.1 软件，使用“Clue GO”插件进行基因本体
        1.3 动物                                             （Gene ontology，GO）分析、京都基因与基因组百科全书
            清洁级 KM 小鼠 60 只，6 周龄，体质量 18 g～22 g，             （Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路
        购自哈尔滨医科大学，动物使用许可证号：SYXK（黑）                         富集分析。以P＜0.05表示信号通路为显著富集。
        2014-003。小鼠饲养于SPF 级动物实验室。                          2.6 动物实验
        2 方法                                               2.6.1  分组、造模及给药        选取50只小鼠随机分为空白
        2.1 沙棘活性成分与相应靶点基因收集与筛选                             组、模型组[皮下注射5％ D-半乳糖溶液，120 mg/（kg·d）；
            在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional                   灌胃AlCl3溶液，20 mg/（mL·d）]、阳性药物组[奥拉西坦，
        Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and  260 mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物组[按 2015 年版《中国
        Analysis Platform，TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/     药典》 人用剂量折算为小鼠等效剂量，即相当于生药量
                                                                [8]
        tcmsp.php）中，以“沙棘”为关键词，以类药性（DL）≥                    1.6 g/（kg·d）；下同]、沙棘多酚提取物组[相当于生药量
        0.18、口服生物利用度（OB）≥30％为条件对化学成分进                      1.6 g/（kg·d）]，每组 10 只。各组小鼠分别灌胃，给予相
        行筛选，获取沙棘活性成分及对应靶点信息，然后在                            应药物的同时给予造模剂，空白组给予等体积的蒸馏
        UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）获取靶点对应        水，每天1次，连续给药治疗60 d。
        基因名，并下载活性成分的三维结构文件，得到沙棘的                           2.6.2  各组小鼠学习记忆能力检测               采用 Morris 水迷
                    [16]
        主要活性成分 。                                           宫实验检测。（1）定位航行实验：给药结束后，以小鼠面
        2.2  沙棘活性成分-疾病靶点网络构建                               向池壁放入水中至找到平台时间为逃避潜伏期。实验
            以“Alzheimer’s disease”为关键词，通过人类基因平             时间设置为120 s，若超时未找到平台，则引导小鼠至平
        台（GeneCards）数据库（https：//www.genecards.org/）获取      台停留片刻，将其逃避潜伏期计为120 s。实验进行5 d，
        AD 的相关靶点，使用 R 语言中 Venny 程序映射活性成                    每天训练 1 次，于第 5 天记录小鼠逃避潜伏期。（2）空间
        分、预测靶点和疾病相关靶点，获得沙棘与AD的交集靶                          探索实验：于水迷宫定位航行实验第6天撤去水池中的
        点，即为沙棘治疗AD的潜在靶点。将“2.1”项下获得的                        平台，将小鼠面向池壁放入无平台的水池中自由游泳。
        沙棘活性成分与沙棘治疗 AD 的潜在靶点，导入生物信                         实验时间设置为 120 s，记录 120 s 内小鼠穿越原来平台
                                                                     [19]
        息分析软件 Cytoscape 3.7.1，构建沙棘活性成分-AD 靶                位置的次数 。
        点网络。网络中的节点（Node）表示靶点或化合物，边                         2.6.3  各组小鼠血清中免疫因子检测和海马体组织病
       （Edge）表示活性成分与疾病之间相互作用。复杂网络                          理学变化观察         采用酶联免疫吸附（ELISA）法和苏木
        节点中心性可用于衡量节点在网络中影响能力大小，以                           精-伊红（HE）染色检测。水迷宫实验结束后，各组小鼠
        判断节点的重要性。其中，度值为重要参数，度值越高                           禁食、自由饮水 24 h。然后将小鼠脱颈处死后，于冰台
        代表该成分或靶点在网络中的位置越重要。                                上迅速剥离大脑并取出海马体。取海马体的一半，制成
        2.3 沙棘治疗AD靶点相互作用网络构建                               10％海马组织匀浆液，4 ℃下以1 000 r/min离心10 min，
            将“2.2”项下映射后的沙棘治疗 AD 的潜在靶点导                     取上清液于4 ℃下保存，严格按试剂盒说明书测定海马
        入蛋白质相互作用（STRING）数据库（https：//string-db.             组织匀浆中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的水平。另一半
        org/），将最低相互作用阈值调整为“中置信度（Medium                     海马体用 4％多聚甲醛固定，采用 HE 法染色，于 100 倍
                                                                                                  [20]
        confidence）”，其值为 0.400，其余参数选择默认设置，获                显微镜下进行图像采集分析，观察其病理结构 。
        得靶点的相互作用关系数据，导入 Cytoscape 3.7.1 软件                 2.6.4  统计学分析       采用SPSS 20.0 统计学软件进行实
        中以“Network analyzer”插件制作靶点相互作用（PPI）网               验数据分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因
          [17]
        络 。选择度值排名靠前的沙棘治疗AD的潜在靶点作                           素方差分析和LSD-t检验。以 P＜0.05 为差异有统计学
        为关键靶点进行分子对接。                                       意义。


        中国药房    2020年第31卷第19期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19  ·2327 ·
   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34