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基于 Nrf2/HO-1 信号通路的夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海

马细胞HT22损伤的保护作用及机制研究 Δ

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1＊
郭 丰 ，黄 山 ，李 斌 （1.白城医学高等专科学校药学系，吉林 白城 137000；2.青岛科技大学药学系，山
东 青岛 266000）
中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）11-1303-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.04

摘 要 目的：基于核因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）信号通路研究夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海马细胞HT22损伤的
保护作用及机制。方法：采用谷氨酸（5 mmol/L）建立 HT22 细胞损伤模型后，以水溶性维生素 E 为阳性对照（50 µmol/L），采用
MTT法检测0（空白对照）、25、50、100 µg/mL夜关门的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞增
殖的影响。以水溶性维生素E为阳性对照（50 µmol/L），采用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针（DCFH-DA）法检测0（空白对照）、
25、50、100 µg/mL夜关门二氯甲烷提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞中活性氧（ROS）水平的影响；以HO-1激动剂钴-原
卟啉为阳性对照，采用Western blotting法检测0（空白对照）、25、50、100 µg/mL夜关门二氯甲烷提取物处理24 h后对细胞中HO-1
蛋白表达的影响；分别采用Western blotting法（药物分别处理0.5、1、1.5 h）和免疫荧光染色法（药物处理1 h）检测100 µg/mL夜关
门二氯甲烷提取物处理后对细胞核内外Nrf2蛋白表达的影响。采用小干扰RNA（si-RNA）转染技术进行HO-1基因沉默后，考察
100 µg/mL夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的存活率以及细胞中ROS水平的影响。结果：与空白对照比较，50、100
µg/mL夜关门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞的存活率（P＜0.05），并降低细胞中ROS水平（P＜0.05）；25、50、100 µg/mL夜关
门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞中HO-1蛋白表达水平（P＜0.05），100 µg/mL夜关门二氯甲烷提取物可显著降低细胞质中
Nrf2蛋白水平并升高细胞核中Nrf2蛋白水平（P＜0.05）。HO-1基因沉默后，夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的促
增殖以及降低ROS水平的作用被逆转（P＜0.05）。结论：夜关门二氯甲烷提取物可通过激活Nrf2信号通路，诱导HO-1蛋白的表
达，从而发挥对谷氨酸诱导损伤HT22细胞的保护作用。
关键词 夜关门；谷氨酸；血红素加氧酶 1；核因子2；小鼠；海马细胞HT22；机制

Study on Protective Effects and Mechanism of Lespedeza cuneata Extracts on Glutamate-induced
Hippocampal Cells HT22 Injury of Mice Based on Nrf2/HO-1 Signaling Pathway
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1
GUO Feng ，HUANG Shan ，LI Bin（1.Dept. of Pharmacy，Baicheng Medical College，Jilin Baicheng 137000，
2
China；2.Dept. of Pharmacy，Qingdao University of Science and Technology，Shandong Qingdao 266000，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the protective effects of Lespedeza cuneata extract on glutamate-induced hippocampal cells
HT22 injury of mice and its possible mechanism based on Nrf2/HO-1 signaling pathway. METHODS：Using glutamate（5 mmol/L）
to extablish the injury model of HT22 cells. Using water soluble vitamin E as positive control（50 µmol/L），MTT assay was used
to detect the effects of 0（blank control），25，50，100 µg/mL petroleum ether extract，dichloromethane extract，ethyl acetate
extract of L. cuneata on the proliferation of glutamate-induced injury cellsafter pretreated for 12 h. Using water soluble vitamin E as
positive control（50 µmol/L），DCFH-DA assay was used to detect the effects of 0（blank control），25，50，100 µg/mL L. cuneata
dichloromethane extract on the level of active oxygen（ROS）in glutamate-induced injury cells after pretreated with 12 h. Using
HO-1 agonist CoPP as positive control，Western blotting method was used to detect the effects of 0（blank control），25，50，100
µg/mL L. cuneata dichloromethane extract on the protein expression of HO-1 after treated for 24 h. Western blotting method
（treated for 0.5，1，1.5 h）and immunofluorescence staining（treated for 1 h）were used to detect the effects of 100 µg/mL L.
cuneata dichloromethane extract on protein expression of Nrf2 inside and outside the nucleus. After HO-1 gene was silenced by
small interfering RNA（Si RNA） transfection technology，the effects of 100 µg/mL L. cuneata dichloromethane extract on the
survival rates of glutamate-induced injury cells and the level of ROS were detected. RESULTS：Compared with blank control，50，
100 µg/mL L. cuneata dichloromethane extract could significantly improve the survival rate of glutamate-induced injury cells（P＜
0.05），while reduced the level of ROS （P＜0.05）. 25，50，
Δ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目（No.81760779，
100 µg/mL L. cuneata dichloromethane extract could increase
No.31500288，No.81360686）
the protein expression of HO-1 in cells（P＜0.05），while 100
＊讲师，硕士。研究方向：天然药物化学。E-mail：gfeng006@163.
µg/mL L. cuneata dichloromethane extract could significantly
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# 通信作者：讲师，硕士生导师，博士。研究方向：中药与民族药 decrease the protein level of Nrf2 in cytoplasm and increase
药理学。E-mail：leebin09@qust.edu.cn that in nucleus （P＜0.05）. After HO-1 gene silencing，the

中国药房 2020年第31卷第11期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 ·1303 ·