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均为25、50、100、200 μg/mL，均以浸膏量计，下同），每组                抑制剂的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解10 min，然后在
        设置3个复孔。各给药组细胞先加入含相应药液的培养                           4 ℃下以 15 000 r/min 离心 20 min，取上清液，置于－
        基预培养 12 h，空白组细胞加入空白培养基，然后加入                        80 ℃冰柜中保存，备用。按 BCA 法测定总蛋白含量。
        50 μL MTT试剂（终质量浓度为0.5 mg/mL），继续培养4                 取 30 μg 总蛋白进行 10％～12％十二烷基硫酸钠-聚丙
        h；吸弃上清液，加入150 μL DMSO溶液，轻微振摇1 min                  烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），条件为电压 120 V、电流
        至DMSO将甲臜结晶完全溶解后，采用酶标仪在490 nm                       300 mA、时间 90 min；电转至硝酸纤维素膜上，用 TBST
        波长处测定各孔的光密度（OD），并计算细胞存活率[细                         缓冲液洗膜 3 次，室温下用封闭剂（5％的脱脂奶粉）孵
        胞存活率（％）＝OD 试验组/OD 空白组×100％]。                       育 2 h；再用 TBST 洗 3 次，加入 HO-1、β-actin 一抗（1 ∶
        2.4  夜关门不同溶剂提取物对谷氨酸诱导细胞损伤的                         1 000），在室温下以封闭剂孵育1.5 h；TBST洗膜3次，加
        影响                                                 入 HRP 标记的二抗（1 ∶ 5 000），在室温下以封闭剂孵育
            按“2.3”项下方法接种、培养细胞后，将细胞分为空                      1 h；TBST 洗膜 3 次，以 ECL 试剂进行显色，利用化学发
        白组、模型组、阳性对照组（水溶性维生素E，50 μmoL/L）                    光成像仪进行分析。通过Gel-Pro Analyzer 4.0软件对蛋
        和夜关门的乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚提取物组（质量                          白条带灰度进行定量分析，以目标条带灰度值与内参
        浓度均为25、50、100 μg/mL），每组设置3个复孔。各给                   β-actin条带灰度值之比表示目标蛋白的表达水平。
                                                           2.7  夜关门二氯甲烷提取物对细胞中Nrf2蛋白表达的
        药组细胞先加入含相应药液的培养基预培养12 h，空白
                                                           影响
        组、模型组细胞加入空白培养基，然后除空白组外，其余
                                                           2.7.1 Western blotting 法检测   按“2.5”项下方法对细
        各组细胞均加入谷氨酸（终浓度为 5 mmol/L）诱导损伤
                                                           胞进行接种和培养后，将细胞分为空白组和夜关门二氯
        24 h，再按“2.3”项下MTT法测定细胞存活率。
        2.5  夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞中                         甲烷提取物组，每组设置3个复孔。空白组细胞不作处
                                                           理，夜关门二氯甲烷提取物组细胞分别用 100 μg/mL 夜
        ROS水平的影响
                                                           关门二氯甲烷提取物处理不同时间（0.5、1、1.5 h）后，吸
            采用 DCFH-DA 法检测细胞中 ROS 水平。将细胞
                                                           弃上清液，加 1 mL 冰磷酸盐缓冲液（PBS），重悬细胞至
                                   4
        用培养基重悬至密度为 2.5×10 个/mL，接种到 24 孔板
                                                           1.5 mL 离心管中，以 300 r/min 离心 3 min；吸弃培养液，
        中，每孔1 mL，将细胞置于37 ℃、5％CO2的培养箱中培
                                                           加入20 μL 含蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制剂的细胞质裂
        养 24 h。然后将细胞分为空白组、模型组、阳性对照组
                                                           解液，于冰上裂解 10 min，然后在 4 ℃下以 15 000 r/min
       （水溶性维生素E，50 μmoL/L）和夜关门二氯甲烷提取物
                                                           离心20 min，取上清液，即为细胞质蛋白溶液；沉淀加入
        不同质量浓度组（25、50、100 μg/mL），每组设置 3 个复
                                                           细胞核裂解液，与细胞质裂解步骤相同，取上清液，即为
        孔。空白组细胞不作处理；模型组细胞在培养 12 h 后，
                                                           细胞核蛋白溶液。采用BCA法测定蛋白含量，然后取蛋
        加入5 mmol/L谷氨酸诱导损伤12 h；各给药组细胞分别
                                                           白按“2.5”项下方法进行电泳试验并分析结果（细胞核
        添加相应药液预处理12 h后，再加入5 mmol/L谷氨酸诱
                                                           中 Nrf2蛋白表达水平测定的内参为Lamin B，细胞质中
        导损伤12 h。吸弃培养液，用无血清和抗体的培养基洗
                                                           Nrf2蛋白表达水平测定的内参为β-actin）。
        细胞 3 遍；用 10 μmoL/L 的 DCFH-DA 避光孵育 30 min，
                                                           2.7.2  免疫荧光法检测         将细胞用培养基重悬至密度
        再用无血清和抗体的培养基洗 3 遍；加入 1％Triton
                                                           为 1×10 个/mL，在 6 孔板中预先加入 12 mm 细胞爬片，
                                                                  5
        X-100 在 37 ℃下孵育 10 min，然后分别在激发波长 488               然后将细胞接种到 6 孔板中，每孔 1 mL。将细胞置于
        nm和发射波长525 nm下用荧光分光光度计测定各孔的                        37 ℃、5％CO2的培养箱中培养 24 h。然后将细胞分为
        荧光强度，计算细胞中 ROS 水平（ROS 水平＝试验组荧                      空白组和夜关门二氯甲烷提取物组，空白组细胞不作处
        光强度/空白组荧光强度）。                                      理，夜关门二氯甲烷提取物组细胞用 100 μg/mL 夜关门
        2.6  夜关门二氯甲烷提取物对细胞中 HO-1 蛋白表达                      二氯甲烷提取物处理 1.5 h 后，吸弃培养液，用 PBS 洗 3
        的影响                                                次；用 4％多聚甲醛在室温固定 20 min，用 0.1％ Triton
            采用 Western blotting 法检测细胞中 HO-1 蛋白表达           X100 孵育10 min，然后用含1％FBS的脱脂奶粉封闭30
        水平。将细胞用培养基重悬至密度为1×10 个/mL，接种                       min；加入 Nrf2 一抗（1 ∶ 200），孵育过夜，用 PBS 冲洗；再
                                            5
        到6孔板中，每孔1 mL。将细胞置于37 ℃、5％CO2的培                     加入FITC标记的二抗（1 ∶ 2 000），避光孵育1 h，PBS洗3
        养箱中培养 24 h。然后将细胞分为空白组、CoPP 组                       次；加入 DAPI（0.5 mg/mL）孵育 5 min，PBS 洗 3 次。将
       （HO-1 激动剂，20 μmmol/L）和夜关门二氯甲烷提取物                    细胞爬片取出，封片，在荧光显微镜下观察并拍照。绿
        不同质量浓度组（25、50、100 μg/mL），每组设置 3 个复                 色荧光为Nrf2阳性染色，蓝色荧光为细胞核染色。
        孔。空白组细胞不作处理，各给药组细胞分别加入相应                           2.8 HO-1基因沉默后夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸
        药液处理24 h。吸弃培养液，加1 mL冰PBS重悬细胞，                      诱导细胞损伤的影响
                                                                                                4
        将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，以300 r/min离心3                       将细胞用培养基重悬至密度为2.5×10 个/mL，接种
        min，吸弃培养液；加入 50 μL 含蛋白酶和磷酸化蛋白酶                     到 24 孔板中，每孔 1 mL。将细胞置于 37 ℃、5％CO2的


        中国药房    2020年第31卷第11期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11  ·1305  ·
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