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effects of L. cuneata dichloromethane extract on the proliferation promotion of glutamate-induced injury cells and the reduction of
ROS level were reversed（P＜0.05）. CONCLUSIONS：L. cuneata dichloromethane extract can protect HT22 cells against injury
induced by glutamate through activating Nrf2 pathway，inducing HO-1 expression.
KEYWORDS Lespedeza cuneata；Glutamate；HO-1；Nrf2；Mice；Hippocampal cells HT22；Mechanism

大脑中的海马神经元损伤是各种神经退行性疾病 91018-1）；Griess 染色试剂盒（美国 Promega 公司，批号：
的重要病理环节 [1-2] 。谷氨酸作为哺乳动物中枢神经系 20190605）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液
统中最重要的兴奋性神经递质，不仅参与了快速的兴奋 （北 京 索 莱 宝 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 ：20190708、
性突触传递，还可以调节神经递质的释放、突触的可塑 20290305）；血红素加氧酶1（HO-1）小鼠单克隆抗体、核
性，参与中枢神经系统正常的生理功能 。然而，细胞间 因子2（Nrf2）小鼠单克隆抗体、β-肌动蛋白（β-actin）小鼠
[3]
隙中谷氨酸浓度过高时会对神经元产生氧化应激与毒 单克隆抗体、核纤层蛋白B（Lamin-B）小鼠单克隆抗体、
性，导致神经元的退化、衰老及死亡，谷氨酸引起的神经 辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠免疫球蛋白 G
毒性是导致神经退行性疾病中神经细胞死亡的重要机 （IgG）二抗、小干扰 RNA 对照品（si-RNA control）、HO-1
制之一 。夜关门为豆科胡枝子属植物夜关门（Lespede- 小干扰 RNA（si-RNA HO-1）、钴-原卟啉（CoPP）（美国
[4]
za cuneata G. Don）的全草，广泛分布于我国大部分地 Santa Cruz 公司）；2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针
[5]
区 ，具有清热解毒、利湿消积等功效 [6-7] 。现代药理学研 （DCFH-DA）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的IgG二抗、
究表明，夜关门具有抗菌、抗炎及抗氧化等多种生物活 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（英国 Abcam 公
性 [8-9] 。此外，有研究发现，夜关门可以通过降低脑组织 司，批号：ab113851、ab188285、ab228549）；Lipofectami-
中一氧化氮（NO）及活性氧（ROS）水平有效地抑制小鼠 ne 2000 转 染 试 剂（美 国 Invitrogen 公 司 ，批 号 ：
TM
实验性失眠 ，而 NO 与 ROS 水平异常则是脑神经毒性 1306267）；MTT 试剂盒、ROS 检测试剂盒、二喹啉甲酸
[10]
的重要指标。因此，本课题组利用谷氨酸诱导小鼠海马 （BCA）试 剂 盒（南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 ，批 号 ：
细胞 HT22 损伤模型，探究夜关门提取物对脑神经保护 804W0515、100-500T、20180317）；其余试剂均为分析
的药效作用及相关机制，为该药用植物的进一步开发利 纯，水为超纯水。
用提供实验依据。 1.3 细胞
1 材料 小鼠海马细胞HT22细胞株由韩国圆光大学金英哲
1.1 仪器 教授赠送。
AS110 R2型分析天平（波兰Radwag公司）；ELx800 2 方法
型多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）；HS-1302型超净工 2.1 夜关门不同溶剂提取物的制备
作台（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；GL-802型 取夜关门药材，打成粗粉，称取粗粉 3 份，各 500 g，
微型台式真空泵（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）； 以 70％乙醇为溶剂、料液比（g/mL）为 1 ∶ 30，在 80 ℃条
CCL-170B-8型CO2恒温培养箱（新加坡艺思高生物科技 件下回流提取，然后分别以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯
有限公司）；XSP-17CV 型倒置生物显微镜（上海巴拓仪 对提取液进行萃取，每种溶剂均萃取3次，每次溶剂用量
器有限公司）；XB-K-25型细胞计数板（深圳市达科为生 均为12、8、6倍（L/kg），每次均萃取2 h；滤过，合并滤液，
物技术有限公司）；Mini P-4型小型垂直电泳系统（北京 用旋转蒸发仪在水浴条件下减压浓缩，然后于 55 ℃水
凯元信瑞仪器有限公司）；Tanon-4600 型化学发光成像 浴 中 挥 干 溶 剂 ，分 别 得 到 石 油 醚 提 取 物（得 率 为
仪（上海天能科技有限公司）；CX31-12C04 型双目生物 2.78％）、二氯甲烷提取物（得率为3.23％）和乙酸乙酯提
荧光显微镜（日本 Olympus 公司）；TDZ5-WS 型冷冻离 取物（得率为3.12％）。
心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。 2.2 细胞的培养
1.2 药品与试剂 将细胞接种于含 10％FBS 和 1％青霉素/链霉素双
夜关门药材于2018年8月采自山东青岛，经青岛科 抗的 DMEM 高糖培养基中，在 37 ℃、5％CO2的培养箱
技大学化工学院黄山教授鉴定为豆科胡枝子属植物夜 中培养，取对数生长期细胞用于试验。
关门（L. cuneata G. Don）的全草；水溶性维生素 E 对照 2.3 夜关门不同溶剂提取物的细胞毒性考察
品、谷氨酸对照品（美国 Sigma 公司，批号：1001270674、 将细胞用含 10％FBS 和 1％青霉素/链霉素双抗的
4
100023-198601，纯度：97％、98％）；二甲亚砜（DMSO，美 DMEM 高糖培养基（下同）重悬至密度为 8×10 个/mL，
国 Amresco 公 司）；DMEM 高 糖 培 养 基 、胎 牛 血 清 接种到 96 孔板中，每孔 100 μL，将细胞置于 37 ℃、5％
（FBS）、0.25％胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗（美国 Gib- CO2的培养箱中培养24 h。然后将细胞分为空白组和夜
co-BRL 公 司 ，批 号 ：2081862、11041-8611、90326-1、 关门的乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚提取物组（质量浓度

·1304 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 中国药房 2020年第31卷第11期