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于钩吻对 CRC 细胞的抑制活性，本研究初步探讨了                           和TAG低、中、高剂量组[40、80、120 μg/mL，剂量参考已
        TAG 在 CRC 血管生成中的作用及可能机制，旨在为钩                        有文献和TAG半数抑制浓度（IC50 ）          [8，10] 设置，下同]，每组
        吻及其活性成分在CRC临床治疗中的应用提供依据。                            设3个复孔。弃去培养基，空白组加入相应完全培养基
        1 材料                                                2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基 2 mL。
        1.1 仪器                                              培养 24 h 后，于倒置荧光显微镜下观察并拍摄细胞
            HF212 UV 型 CO2培养箱（力康生物医疗科技控股                    形态。
        有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪[赛默飞世尔（上海）                   2.4 细胞活力检测
        仪器有限公司]；FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公                        采用CCK-8法检测。取对数生长期的HT-29细胞、
        司）；IX70 型倒置荧光显微镜（日本 Olympus 公司）；                    HUVEC 各适量，经含 EDTA 的胰蛋白酶消化、计数后，
        TDZ4A-WS型低速水平离心机（湖南湘仪实验室仪器开                         以1.0×10 个/mL按每孔100 μL接种至96孔板中，培养，
                                                                    5
        发有限公司）。                                             待细胞融合至 50％～60％后，将其随机分为空白组、
        1.2 药品与试剂                                           DMSO 组和 TAG 低、中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），
            钩吻药材购自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地，经福                          每组设6个复孔。弃去培养基，空白组加入相应完全培
        建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为钩吻真品。                             养基100 μL，DMSO组加入含DMSO 0.5 μL的完全培养
        TAG 冻干粉由福建中医药大学药学院中药药效物质基                           基 100 μL，各给药组加入含相应药物的完全培养基 100
        础实验室制备（得率为0.6％）。
                                                            μL。培养24 h后，加入CCK-8试剂10 μL，避光培养4 h，
            0.25％胰蛋白酶（批号：2048080）、胎牛血清（FBS，
                                                            使用酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）
        批号：1982158C）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：
                                                            值，并计算细胞存活率：存活率＝（空白组平均 OD 值－
        8119049）、RPMI 1640 培养基（批号：8119022）、青链霉
                                                            试验组平均 OD 值）/空白组平均 OD 值×100％。上述试
        素（批号：2019313）均购自美国Gibco公司；McCoy’s 5A
                                                            验重复3次。
        培养基（江苏凯基生物技术有限公司，批号：20190212）；
                                                            2.5  HT-29细胞周期变化检测
        CCK-8试剂盒（美国MCE公司，批号：30116）；碘化丙啶/
                                                                采用流式细胞术检测。取对数生长期的 HT-29 细
        核 糖 核 酸 酶（PI/RNase）染 料（美 国 BD 公 司 ，批 号 ：
                                                            胞适量，经不含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1.0×
        9039585）；Triton X-100 试剂[爱必信（上海）生物科技有
                                                            10 个/mL 按每孔 2 mL 接种至 6 孔板中，培养，待细胞融
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        限公司，批号：J02N]；结晶紫试剂（批号：1130P041）、
                                                            合至 50％～60％后，将其随机分为空白组和 TAG 低、
        Matrigel 基质胶（批号：20190218）均购自北京索莱宝科
                                                            中、高剂量组（40、80、120 μg/mL），每组设 3 个复孔。弃
        技 有 限 公 司 ；二 甲 基 亚 砜（DMSO）、乙 二 胺 四 乙 酸
                                                            去培养基，空白组加入 McCoy’s 5A 完全培养基 2 mL，
        （EDTA）等试剂均为分析纯，水为超纯水。
                                                            各给药组加入含相应药物的 McCoy’s 5A 完全培养基 2
        1.3  细胞
                                                            mL。培养 24 h 后，吸弃上清液，收集细胞，用 4 ℃ PBS
            人 CRC HT-29 细胞、HUVEC 均购自中国科学院上
                                                            清洗后，置于 70％乙醇中，于－20 ℃固定过夜，以 1 000
        海生科院细胞资源中心。
                                                            r/min离心5 min，收集细胞，用PBS清洗后，加入含0.2％
        2 方法
                                                            Triton X-100 试剂的 PI/RNase 染料 0.5 mL，避光孵育 30
        2.1  药液配制
                                                            min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况并使用
            取 TAG 冻干粉 100 mg，溶于 DMSO 4 mL 中，配成
                                                            Modfit 5.0周期拟合软件进行分析。上述试验重复3次。
        质量浓度为 25 mg/mL 的 TAG 母液，于 4 ℃保存，备用。
                                                            2.6 HUVEC迁移能力检测
        临用前用McCoy’s 5A完全培养基或RPMI 1640完全培
        养基（即含有 10％FBS、1％青链霉素的 McCoy’s 5A 培                      采用划痕试验检测。取对数生长期的 HUVEC 适
                                                                                                      5
        养基或RPMI 1640培养基）稀释至相应质量浓度。                          量，经含EDTA的胰蛋白酶消化、计数后，以1×10 个/mL
        2.2 细胞培养                                            按每孔 2 mL 接种至 6 孔板中，培养，待细胞铺满后，用
            将 HT-29 细胞和 HUVEC 分别接种至含 McCoy’s                200 μL 枪头在每孔底部中央作一划痕，用 PBS 清洗后，
        5A完全培养基和RPMI 1640完全培养基中，置于37 ℃、                     将细胞随机分为空白组和TAG低、中、高剂量组（40、80、
        5％CO2条件下培养（培养条件下同）。                                 120 μg/mL），每组设3个复孔。弃去培养基，空白组加入
        2.3 细胞形态观察                                          RPMI 1640完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物
            使用倒置荧光显微镜观察。取对数生长期的HT-29                        的 RPMI 1640 完全培养基 2 mL。分别于培养的 0、24 h
        细胞、HUVEC 各适量，经含 EDTA 的胰蛋白酶消化、计                      时拍照，并使用 Image Pro-Plus 6.0 软件分析结果，计算
        数后，以 1.0×10 个/mL 按每孔 2 mL 接种至 6 孔板中，培               迁移率：迁移率＝（0 h时迁移距离－24 h时迁移距离）/0
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        养，待细胞融合至 50％～60％后，将其随机分为空白组                         h时迁移距离×100％。上述试验重复3次。


         ·958  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 8                                  中国药房    2020年第31卷第8期
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