Page 60 - 2020年1月第31卷第2期

4 讨论
β-actin 42 kDa 马钱子为马钱科植物马钱的干燥成熟种子，具有通
络止痛、散结消肿的功效，常用于治疗跌打损伤、骨折肿
[6]
Caspase-3 17 kDa 痛、风湿顽痹、麻木瘫痪、痈疽疮毒、咽喉肿痛等 。近年
来，关于马钱子活性成分抗肿瘤作用的研究取得了一定
[7]
Caspase-9 37 kDa 成果 。前期研究证实，伪士的宁作为马钱子中提取获
得的生物碱单体化合物，对结肠癌具有一定的抑制作
用，且毒副作用较小。因此，本研究通过考察伪士的宁
P53 53 kDa
作用于HT-29细胞后对其凋亡、线粒体跨膜电位及相关
凋亡蛋白表达水平等的影响，对该化合物抗结肠癌的可
c-PARP 85 kDa
能作用机制进行了初步的探讨。
正常情况下，细胞线粒体外膜为高通透性，而内膜
Bcl-2 26 kDa
通透性相对较低，线粒体内膜上存在的质子泵可将基质
空白组 伪士的宁 伪士的宁 伪士的宁
低剂量组 中剂量组 高剂量组 中的质子泵入膜外，从而使得线粒体膜内外形成跨膜电
图4 各组细胞中相关蛋白表达的电泳图 位 。线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆
[8]
Fig 4 Electrophoretogram of related protein expres- 事件 。当线粒体膜内外的电势差减少时，线粒体膜电
[7]
sion in cells of each group 位降低，可引起线粒体膜内外发生一系列生化改变。在

表3 各组细胞中相关凋亡蛋白表达水平测定结果（x±±s，n＝3）
Tab 3 Results of expression levels of apoptosis-related proteins in cells of each group（x±±s，n＝3）
组别 P53/β-actin Caspase-3/β-actin Caspase-9/β-actin c-PARP/β-actin Bcl-2/β-actin
空白组 0.257 9±0.037 5 0.086 1±0.021 2 0.162 1±0.039 8 0.126 1±0.020 2 0.674 5±0.048 1
伪士的宁低剂量组 0.360 0±0.024 3 0.115 9±0.018 6 0.247 1±0.076 0 0.235 7±0.056 9 0.517 2±0.081 7 ＊
伪士的宁中剂量组 0.524 1±0.055 9 ＊＊ 0.208 8±0.016 8 ＊＊ 0.428 7±0.068 0 ＊ 0.381 5±0.098 1 ＊＊ 0.319 0±0.076 9 ＊＊
伪士的宁高剂量组 0.660 0±0.090 1 ＊＊ 0.286 5±0.034 6 ＊＊ 0.662 9±0.170 5 ＊＊ 0.545 1±0.117 3 ＊＊ 0.236 8±0.057 9 ＊＊
＊＊
＊
注：与空白组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
Note：vs. blank group， P＜0.05， P＜0.01
各种促细胞凋亡信号作用下，线粒体通透性转变孔不可 实施蛋白通过作用于特异性底物使细胞发生凋亡，Cas-
逆地过度开放，导致线粒体跨膜电位崩解、呼吸链解耦 pase 活化可导致细胞凋亡进入不可逆阶段 。Cas-
[11]
联、线粒体基质渗透压升高、内膜肿胀，并释放出膜间促 pase-3是Bcl-2的下游调控蛋白；PARP是Caspase-3的切
[9]
凋亡蛋白，最终导致细胞凋亡 。因此，线粒体跨膜电位 割底物，也是 Caspase-3 激活的标志。Caspase-3 被激活
的改变预示细胞可能出现凋亡，可为细胞凋亡的机制研 后 构 象 发 生 改 变 形 成 剪 切 体 cleaved-Caspase-3，
究提供一定的理论基础。 cleaved-Caspase-3 进一步剪切 PARP，使总 PARP 减少、
本研究结果显示，与正常对照组比较，不同剂量伪 cleaved-PARP增加，导致PARP失去正常功能，最终使得
士的宁作用于HT-29细胞48 h后，能显著升高细胞凋亡 核小体间 DNA 降解、细胞发生凋亡 [10] 。P53 是 Bcl-2 的
率（P＜0.01），表明伪士的宁具有明显的促HT-29细胞凋 上游调控基因，P53 通过调节 Caspase-3 蛋白酶上调
[12]
亡的作用，且这一作用呈浓度依赖趋势；同时，不同剂量 Bcl-2的基因表达，从而影响相关凋亡功能 。本研究结
的伪士的宁均能显著降低 HT-29 细胞的线粒体跨膜电 果显示，中、高剂量伪士的宁作用于 HT-29 细胞后，Cas-
位（P＜0.01），并使电位由聚集态向离散态变化的趋势 pase-3、Caspase-9、P53、c-PARP（PARP 的活化形式）的蛋
增大，且这一作用呈浓度依赖趋势。 白表达水平均显著升高，低、中、高剂量伪士的宁作用后
Bcl-2 家族由抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL 等）和促凋 使细胞中 Bcl-2 蛋白表达均显著下调，表明其能够通过
亡蛋白（Bax、Bak等）组成，共同构成一个相互作用的控 调控P53、Caspase-3、PARP、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达
制细胞凋亡的网络，是细胞凋亡内源性线粒体途径的重 诱导HT-29细胞发生凋亡。
要调节因子 。Bcl-2 是细胞凋亡的负调节因子。Cas- 综上所述，伪士的宁可能通过上调 P53 蛋白、下调
[10]
pase 家族蛋白分为启动子（包括 Caspase-2、Caspase-8、 Bcl-2 蛋白的表达，改变线粒体膜电位，然后激活 Cas-
Caspase-9）和 效 应 器（包 括 Caspase-3、Caspase-6、Cas- pase-3、c-PARP、Caspase-9的表达，进而激活内源性线粒
pase-7），启动子的作用是在各种刺激下（如药物、生长因 体通路，发挥促进结肠癌HT-29细胞凋亡的作用。但该
子等）发生自我激活并识别和活化下游的Caspase蛋白， 化合物对结肠癌细胞的具体促凋亡途径还有待于进一

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