Page 63 - 2020年1月第31卷第2期

克林生化科技有限公司，批号：C10026034）；α-葡萄糖苷 多糖 50 mg，置具塞试管中，加入 2 mol/L 三氟乙酸溶液
酶对照品（美国 Sigma 公司，批号：SLBX6245）；阿卡波 2 mL，混匀，密封，于100 ℃水解8 h，蒸干，残渣加甲醇1
糖对照品（批号：J1824027）、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃 mL，蒸干，重复 3～5 次；残渣加水 8 mL 复溶，即得多糖
苷（PNPG）对照品（批号：E1828029）均购自阿拉丁试剂 水解液。取上述多糖水解液200 μL置于具塞试管中，按
（上海）有限公司；上述对照品的纯度均大于 98％。0.1 “2.2.1”项下方法进行衍生化处理，即得供试品溶液，
mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 6.8，福州飞净生物科技 备用。
有限公司）；乙腈、磷酸二氢钾（KH2PO4 ）、PMP等均为色 2.2.3 阴性对照溶液
谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。 按“2.2.1”项下方法制备不含单糖对照品的阴性对
1.3 药材 照溶液，备用。
广金钱草药材（编号：S1～S18）采自广东省各栽培 2.3 HPLC指纹图谱的建立
基地，经广东药科大学中药学院中药资源系杨全教授鉴 2.3.1 方法学考察
定为豆科植物广金钱草[D. styracifolium（Osb.）Merr.]的 （1）精密度试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：
地上部分。药材样品来源见表1。 S16）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，以葡萄
表1 药材样品来源 糖峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面
Tab 1 Sample resource of D. styracifolium 积。结果，9 个共有峰相对保留时间和相对峰面积的
编号 采集地 编号 采集地 编号 采集地 RSD均小于3％（n＝6），表明该方法的精密度良好。
S1 广东广州市番禺区 S7 广东梅州市平远县 S13 广西桂林市中庸乡 （2）稳定性试验：取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：
S2 广东肇庆市德庆县 S8 广东梅州市平远县 S14 广西桂林市宛田乡 S16）适量，分别于室温下放置 0、4、8、12、16、24 h 时按
S3 广东湛江市遂溪县 S9 广西桂林市五通镇 S15 广西桂林市宛田乡
S4 广东云浮市苹塘镇 S10 广西桂林市五通镇 S16 广西玉林市文地镇 “2.1”项下色谱条件进样测定，以葡萄糖峰为参照，记录
S5 广东茂名市那务镇 S11 广西桂林市中庸乡 S17 广西玉林市同心田 各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，9 个共
S6 广东茂名市那务镇 S12 广西桂林市中庸乡 S18 广西玉林市下多豪
有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均小于 5％
2 方法与结果 （n＝6），表明供试品溶液于室温放置24 h内基本稳定。
2.1 色谱条件 （3）重复性试验：取药材样品（编号：S16）适量，粉
色谱柱：Phenomenex Luna C18 （250 mm×4.6 mm，5 碎，精密称取粉末适量，共 6 份，按“2.2.2”项下方法制备
μm）；流动相：乙腈（A相）-0.05 mol/L KH2PO4溶液（用氢 供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以葡萄
氧化钠调节pH至6.8，B相），梯度洗脱（0～30 min，17％ 糖峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面
A→19％A；30～50 min，19％A）；流速：0.8 mL/min；检测 积。结果，9 个共有峰相对保留时间和相对峰面积的
波长：250 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。 RSD均小于5％（n＝6），表明本方法重复性良好。
2.2 溶液的制备 2.3.2 HPLC指纹图谱生成与相似度、共有峰相关分析
2.2.1 混合单糖对照品贮备液及其衍生化溶液 （1）HPLC 指纹图谱的生成：取 18 批药材样品各适
精密称取鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿 量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下
拉伯糖对照品各适量，置同一量瓶中，加水配制成质量 色谱条件进样测定。采用《中药色谱指纹图谱相似度评
浓度分别为 0.33、0.88、1.89、0.82、0.45 mg/mL 的混合单 价系统》（2012版）对18批药材样品的HPLC指纹图谱进
糖对照品贮备液。精密吸取上述混合单糖对照品贮备 行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。
液 200 μL，置于具塞试管中，依次加入 0.3 mol/L 氢氧化
1 000
钠溶液200 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL，混匀，
900
密封，于 70 ℃反应 1 h，取出，冷却至室温；精密加入 0.3 800
700
mol/L盐酸溶液200 μL调pH至中性，加入12.5％KH2PO4
溶液200 μL，摇匀，再加入等体积氯仿萃取3次；弃去氯 600
mV 500 S18
仿液，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得混合单糖对 U， S17
S16
400 S15
S14
照品衍生化溶液，备用。 S13
S12
300 S11
S10
2.2.2 粗多糖及其供试品溶液 200 S9
S8
S7
采用水提醇沉法提取广金钱草多糖。称取广金钱 100 S6
S5
S4
S3
S1
草药材样品适量，粉碎，取粉末5 g，用沸水200 mL回流 0 S2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50
提取3次，每次1 h；趁热滤过，合并滤液，浓缩后以5 000 t，min
r/min 离心 10 min；取上清液，加适量乙醇至含醇量为 图1 18批药材样品的HPLC叠加指纹图谱
80％（V/V），于 4 ℃冰箱中放置过夜；以 5 000 r/min 离心 Fig 1 Superposed HPLC fingerprints of 18 batches of
5 min，收集沉淀，冻干，即得粗多糖。精密称取上述粗 samples
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