Page 58 - 2020年1月第31卷第2期
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用尚未见报道。因此，本研究考察了伪士的宁对 HT-29                         2 方法
        细胞的线粒体跨膜电位、细胞凋亡、相关凋亡蛋白等的                            2.1 细胞培养
        影响，并初步探讨其抗结肠癌的可能作用机制，旨在为                                将 HT-29 细胞置于含 10％FBS+1％青霉素-链霉素
        该单体化合物临床用于结肠癌的治疗提供实验基础。                             双抗混合溶液       [4-5] 的 5A 培养基（即完全培养基）中，在

                                    N                       37 ℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞处于
                                                            对数生长期时用于后续试验。
                                  OH
                              N                             2.2 伪士的宁对HT-29细胞凋亡的影响考察
                                                                取处于对数生长期、生长状态良好的 HT-29 细胞，
                            O       O
                                  H                         以 2.5×10 个/孔接种于 6 孔板中，在 37 ℃、5％CO2培养
                                                                    5
                       图1 伪士的宁结构式
                Fig 1 Structure of pseudostrychnine         箱中培养过夜。将细胞分为空白组和伪士的宁低、中、
                                                            高剂量组（125、250、500 μmol/L；剂量根据本课题组前期
        1 材料
                                                            研究结果制定），分别加入不含药的5A培养基或含有相
        1.1 仪器
                                                            应浓度药物的5A培养基后，在37 ℃、5％CO2、饱和湿度
            Cyto FLEX 型流式细胞仪（美国 Beckman 公司）；
                                                            条件下培养 48 h。取出细胞，用 0.25％胰蛋白酶消化细
        MCO-15AC 型 CO2恒温培养箱（台湾 Sanyo 公司）；IX51
                                                            胞并收集细胞，以 1 000 r/min 离心 5 min；除去上清液，
        型倒置显微镜（日本 Olympus 公司）；DYCZ-24DN 型垂
                                                            加入适量 PBS 重悬、润洗 2 次后，以 1 000 r/min 离心 5
        直电泳仪、DYCZ-40 型电转仪（北京六一仪器厂）；
                                                            min；除去上清液，将细胞重悬于 PBS 100 μL 中，缓慢加
        5702R型低速离心机（德国Eppendorf公司）；微量移液器
                                                            入预冷的80％乙醇700 μL，再加入Binding Buffer 500 μL
        （美国Thermo Fisher公司）。
                                                            重悬细胞；加入AnnexinV-FITC试剂5 μL混匀后再加入
        1.2  药品与试剂
                                                            PI 试剂 5 μL，轻轻振摇混匀，室温避光反应 15 min 使染
            伪士的宁对照品（本课题组自制：参照前期研究工
                                                            色；采用流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。
        艺，取马钱子药材，经加热回流提取，硅胶柱色谱、薄层
                                                            2.3  伪士的宁对 HT-29 细胞线粒体跨膜电位的影响
        色谱、半制备高效液相色谱等分离纯化，即得；纯度：
                                                            考察
        95.0％）；0.25％胰蛋白酶（批号：15050065）、胎牛血清
                                                                按“2.2”项下方法取HT-29细胞接种、培养、分组、加
        （FBS，批号：10099-141）、Mc Coys 5A 培养基（简称“5A
                                                            入相应药物并培养 48 h 后，收集细胞，以 1 000 r/min 离
        培养基”，批号：16600-082）均购自美国Gibco公司；青霉
                                                            心5 min，除去上清液，用PBS洗涤细胞3次；以0.25％胰
        素-链霉素双抗（批号：PB180120）、pH 7.4磷酸盐缓冲液
                                                            蛋白酶消化并收集细胞，以1 000 r/min离心5 min；弃去
        （PBS，批号：PB180327）均购自武汉普诺赛生命科技有
                                                            上清液，加入适量PBS重悬、润洗3次，收集不多于1×10                   6
        限公司；细胞凋亡检测试剂盒（批号：KGA108）、线粒体
        膜电位检测试剂盒（批号：KGA602）均购自南京凯基生                         个/mL 的细胞，以 JC-1 工作液（取 10×Incubation Buffer，
                                                            以灭菌水稀释成1×Incubation Buffer，预热至37 ℃；吸取
        物科技发展有限公司；蛋白Marker（加拿大Fermentas公
                                                            线粒体膜电位检测试剂盒中的 JC-1 试剂 1 μL，加入 1×
        司，批号：26619-1）；兔源 DNA 修复酶（PARP）多克隆抗
        体（美国 Affinity 公司，批号：AF7023）；兔源 P53 多克隆              Incubation Buffer 1 000 μL稀释，即得）1 000 μL混悬，在
        抗体（批号：10442-1-AP）、鼠抗人β-actin单克隆抗体（批                 37 ℃、5％CO2的培养箱中培养 20 min；室温下以 1 200
        号：BM0627）、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠二                       r/min离心5 min，收集细胞，用1×Incubation Buffer润洗2
        抗（批 号 ：BA1051）、HRP 标 记 羊 抗 兔 二 抗（批 号 ：              次，再以 10×Incubation Buffer 200 μL 重悬细胞后，用流
        BA1054）均购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人                         式细胞仪检测分析其跨膜电位变化。
        Caspase-3 单克隆抗体（批号：ab184787）、兔抗人 Cas-               2.4  伪 士 的 宁 对 细 胞 中 Caspase-3、P53、Caspase-9、
        pase-9 单克隆抗体（批号：ab202068）、兔源 Bcl-2 多克隆              c-PARP、Bcl-2蛋白表达的影响考察
        抗体（批号：ab59348）均购自英国Abcam公司；ECL化学                        采用 Western blotting 法测定细胞中各目标蛋白的
        发光底物试液（美国Thermo Scientific Pierce公司，批号：             表达水平。取“2.2”项下HT-29细胞接种、培养、分组、加
        NCI5079）；X 光胶片（日本柯达公司，批号：XBT-1）；显                   入相应药物并培养 48 h 后，弃去培养液，以 PBS 洗涤 3
        影定影试剂盒（天津市汉中摄影材料厂）；其余试剂均为                           次；弃去PBS液，培养皿冰浴，每皿细胞加入含PMSF的
        分析纯或实验室常用规格，水为去离子水。                                 裂解液进行裂解后，提取蛋白。取蛋白40 μg，在60 V电
        1.3  细胞                                             压下电泳，待 Marker 出现红色条带时，将电压升至 120
            人结肠癌 HT-29 细胞（批号：CL-0118）购自武汉普                  V 继续电泳；然后电转移至 PVDF 膜上，用含 5％脱脂
        诺赛生命科技有限公司。                                         奶粉的 TBST 缓冲液在室温条件下摇床封闭 2 h，加入


        ·180  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2                                   中国药房    2020年第31卷第2期
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